老年慢性乙型肝炎患者用藥治療后乙肝病毒耐藥基因多位點變異

趙 帥 孫靜娜 代麗麗 李彥明 單保恩 耿玉蘭 魏從真

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031)

·消化、呼吸系統(tǒng)疾病·

老年慢性乙型肝炎患者用藥治療后乙肝病毒耐藥基因多位點變異

趙 帥 孫靜娜 代麗麗 李彥明 單保恩1耿玉蘭 魏從真

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031)

目的 分析拉米夫定(LAM)和恩替卡韋(ECV)聯(lián)合用藥及單獨用LAM后老年乙肝患者乙肝病毒(HBV)耐藥基因突變位點及與基因型的關系。方法 選擇治療前未檢測出HBV-YMDD變異的老年乙肝患者100例，隨機分為兩組，在患者治療后24個月檢測基因分型和反轉錄酶(RT)區(qū)位點變異。結果 聯(lián)合用藥組中檢出耐藥突變類型分別為rtT184L+L180M+M204V、rtT184L+S202G+L180M+M204V、rtM250L+M204I；單用藥組檢出耐藥基因突變類型分別為rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtM204I。結論 初期使用LAM聯(lián)合ECV治療老年乙肝患者24個月后耐藥突變率僅為6%；聯(lián)合用藥在B和C兩種基因型中的耐藥檢出率沒有明顯不同。

聯(lián)合用藥；恩替卡韋；拉米夫定；慢性乙肝；基因型；RT區(qū)位點變異

慢性乙肝患者長期使用核苷類藥物治療后乙肝病毒(HBV)耐藥基因位點變異是常見并不可避免的現(xiàn)象，老年乙肝患者發(fā)病率高，且并發(fā)癥出現(xiàn)也較多，合并急性肝衰竭可達25%，肝炎病死率超過10%〔1〕。本研究觀察恩替夫韋(ECV)聯(lián)合拉米夫定(LAM)治療老年乙肝患者24個月后血清基因型及HBV反轉錄酶(RT)區(qū)耐藥率和突變類型，了解聯(lián)合用藥在慢性乙肝治療和轉歸中預防或降低耐藥率的有效性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院2012年1～12月門診及住院老年慢性乙肝患者100例，治療前未檢測出HBV-YMDD變異，男67例，女33例，年齡62～70歲。分為聯(lián)合用藥組(50例)每日口服LAM 50 mg和ECV 0.5 mg，單獨用藥組(50例)每日單用 LAM 100 mg。兩組一般資料無顯著差異。

1.2 樣本采集與貯存 治療24個月后，采集靜脈血于促凝真空采血管中，每管3 ml，離心后取上清，檢測基因型，分析 RT 區(qū)(rt180M、rt184L、rt204V、rt204I、rtS202、rtM250)位點變異。

1.3 檢測方法 HBV基因型分析、RT區(qū)耐藥突變基因檢測采用PCR-反向點雜交芯片法，儀器為檢測儀器為BYQ6056E-298擴增儀和YN-H16雜交儀。試劑購自深圳亞能生物有限公司。所有操作步驟嚴格按說明書進行，同期室內(nèi)質(zhì)控合格。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

聯(lián)合用藥組檢出HBV耐藥基因突變共3例，其變異類型分別為rtT184L+L180M+M204V(C基因型)、rtT184L+S202G+L180M+M204V(C基因型)、rtM250L+M204I(B基因型)各1例。C基因型33例中檢出2例耐藥突變，B基因型17例中檢出1例耐藥突變，兩種基因型之間無統(tǒng)計學差異(校正χ2=0.36，P>0.05)，單獨用藥組檢出HBV耐藥基因突變共23例，其變異類型分別為rtL180M+M204V(6例，其中C基因型4例、B基因型2例)、rtL180M+M204I(5例，其中C基因型3例、B基因型2例)、rtM204I(12例，其中C基因型9例、B基因型3例)。C基因型35例中檢出16例耐藥突變，B基因型15例中檢出7例患者耐藥突變，兩種基因型無統(tǒng)計學差異(χ2=0.00，P>0.05)。

3 討 論

慢性乙肝體內(nèi)HBV DNA的不斷復制可導致肝硬化甚至肝癌，抗病毒藥物核苷類似物可以干擾病毒DNA的合成，終止HBV的復制，但是長期服用核苷類似物藥物可導致HBV產(chǎn)生耐藥性。LAM是一種在結構上與核苷酸類似，可替代核苷酸參與DNA和RNA的合成過程，從而達到終止病毒復制的目的。研究〔2〕結果顯示，LAM可迅速有效抑制HBV復制，長期應用可以顯著改善肝細胞壞死并緩解肝臟纖維化進程，隨著LAM的長期使用會產(chǎn)生耐藥性，引起HBV P基因區(qū)180位點或204位點發(fā)生突變，影響了長期的治療效果，5年耐藥率高達60%～70%〔3〕。ECV是國內(nèi)新上市的鳥嘌呤核苷類抗病毒藥物，初治患者具有耐藥率低，抗HBV強的特點，且在有效抑制 HBV-DNA復制、降低患者體內(nèi)病毒載量的同時間接改善機體T細胞亞群免疫功能。Colonno等〔4〕發(fā)現(xiàn)，ECV在對LVD耐藥的患者的搶救性治療后96 w，耐藥率為9%,LAM耐藥的常見突變位點為rtM204I和rtL180M，經(jīng)ECV用藥后進一步增加出現(xiàn)rtT184、rtS202或rtM250等位點的突變，即出現(xiàn)多個位點的突變。有研究〔5～7〕結果顯示，LAM耐藥后會導致對ECV的敏感性下降近60倍，使治療出現(xiàn)耐藥基因突變后的挽救措施越來越困難，因此預防耐藥基因突變的出現(xiàn)及優(yōu)化治療方案比耐藥后的挽救顯得越來越重要。目前聯(lián)合治療乙型肝炎已逐漸被國內(nèi)外學者關注和認可，國外研究顯示〔8〕，LAM聯(lián)合ECV用藥可使肝臟炎癥在早期得到控制、對于肝纖維化的出現(xiàn)起到預防干預及延緩逆轉的作用，療效更佳。

楊瑞鋒等〔9〕研究顯示，DNA微陣列芯片法檢測HBV耐藥突變有很好的準確性，檢測結果與克隆測序完全符合率達95.5%(214/224)。近些年來，基因芯片技術標準化，具有檢測微量基因突變的高敏感性，由于具備快速和易于自動化等優(yōu)勢，可同時進行多種基因聯(lián)合檢測的特點，逐漸成為遺傳疾病篩查及微生物耐藥檢測領域的前沿技術并開始在臨床廣泛使用〔10～12〕。薛瑞霞等〔13〕研究顯示B、C基因型在我國慢性乙肝患者中為主要出現(xiàn)的基因型，且ECV多為LAM耐藥后加用或換用，使rtM204V+rtL180M+rtT184L成為目前我國ECV耐藥的主要變異類型，此結果與本研究結果相似。

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5 Langley DR,Walsh AW,Baldick CJ,etal.Inhibition of hepatitis B virus polymerase by Entecavir〔J〕.J Vir,2007;81(8):3992-4001.

6 Park JW,Kim HS,Seo DD,etal.Long-term efficacy of entecavir in adefovir-refractory chronic hepatitis B patients with prior lamivudine resistance〔J〕.J Viral Hepat,2011;18(10):475-81.

7 Ling R,Harrison TJ.Functional analysis of mutations conferring lamivudine resistance on hepatitis B virus〔J〕.J Gen Virol,1999;80(Pt 3):601-6.

8 Schiff ER,Lee SS,Chao YC,etal.Long-term treatment with entecavir induces reversal of advanced fibrosis or cirrhosis in patients with chronic hepatitis B〔J〕.Clin Gastroen Hepatol,2011;9(3):274-6.

9 楊瑞鋒,杜紹財,叢 旭,等.DNA微陣列芯片法檢測慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韋酯耐藥突變〔J〕.中華檢驗醫(yī)學雜志,2010;33(11):1049-53.

10 張 華,劉宇清,王幼勤,等.遺傳性耳聾基因芯片檢測及其臨床意義〔J〕.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009;23(11):1032-5.

11 Zhu LX,Zhang ZW,Liang D,etal.Multiplex asymmetirc PCR-based oligonucleotide microarray for detection of dru g resistance genes containing single mutations in Enterobacteriaceae〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2007;51:3707-13.

12 Guo Y,Zhou Y,Wang C,etal.Rapid，accurate determination of nmhidrug resistance in Mtuberculosis isolates and sputum using a biochip system〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis,2009;13:914-20.

13 薛瑞霞,張繚云,楊 松,等.恩替卡韋治療失敗的慢性乙型肝炎患者耐藥分析20例〔J〕.世界華人消化雜志,2009;17(12):1260-3.

〔2016-02-23修回〕

(編輯 苑云杰)

河北省衛(wèi)生廳科研立項(20130565)

魏從真(1984-)，女，主管檢驗師，碩士，主要從事微生物免疫檢驗研究。

趙 帥(1982-)，女，主管檢驗師，碩士，主要從事微生物免疫檢驗研究。

R512.6

A

1005-9202(2017)10-2484-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.061

1 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院檢驗科