長爪沙鼠NAFLD模型的建立及其遺傳學(xué)的研究

劉月環(huán)，吳舊生，應(yīng)華忠，徐承富，石巧娟，余陳歡

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013； 2. 浙江大學(xué)，杭州 310058)

專題研究

長爪沙鼠NAFLD模型的建立及其遺傳學(xué)的研究

劉月環(huán)1，吳舊生2，應(yīng)華忠1，徐承富2，石巧娟1，余陳歡1

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013； 2. 浙江大學(xué)，杭州 310058)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為目前主要代謝性疾病之一，針對傳統(tǒng)的動物模型的缺陷，本研究首次建立了與人類NAFLD(從單純脂肪肝到脂肪性肝炎，再進(jìn)展到肝纖維化、肝硬化)極為相似、飼料配方簡便的長爪沙鼠NAFLD模型，闡明了長爪沙鼠肝臟脂肪快速沉積的特征，揭示長爪沙鼠脂肪肝易感的分子機(jī)制、主要的調(diào)控靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)作用特征，為臨床治療及新藥研發(fā)提供一種背景相對清晰，耗時短的新型脂肪肝動物模型，同時也為NAFLD發(fā)病機(jī)制及藥效新靶點(diǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)動物支撐，為選育近交系NAFLD長爪沙鼠奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

非酒精性脂肪性肝?。?長爪沙鼠模型；遺傳基礎(chǔ)

1 研究背景

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的病理譜包括單純性脂肪肝(Simple fatty liver)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纖維化(hepatic Fibrosis)和肝硬化(hepatocirrhosis)等一系列相互聯(lián)系的病程變化,其發(fā)生與肥胖、高血壓、高血糖、血脂異常等代謝性疾病密切相關(guān)。伴隨著我國人口老齡化日益嚴(yán)重、生活水平的提高和肥胖的產(chǎn)生，NAFLD發(fā)病率越來越高。因此，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制及防治手段已成為我國醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。由于傳統(tǒng)模型的缺陷，使得該病的研究尚未有實(shí)質(zhì)性突破。實(shí)驗(yàn)動物遺傳育種學(xué)是基于動物本身的遺傳特性，利用傳統(tǒng)和現(xiàn)代的生物技術(shù)手段，培育新的動物品種品系，也包括將家養(yǎng)動物和野生動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物化，以服務(wù)于研究與應(yīng)用。自1978年以來，Z：ZCLA長爪沙鼠逐漸從野生到實(shí)驗(yàn)動物化，建封閉群及保種工作也已完善，從2003年到2015年間連續(xù)獲國家科技支撐計劃的支持，被列入國家保種試點(diǎn)，但對封閉群的定向培育一直未開展。

1.1 實(shí)驗(yàn)長爪沙鼠的馴化、兩個級別封閉群的建立及第一次產(chǎn)業(yè)化

ZCLA長爪沙鼠是浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心自1978年以來從野生馴養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)動物的嚙齒類動物，朱智勇等于1983年起用該動物研制并生產(chǎn)了人用流行性出血熱疫苗，產(chǎn)值曾過億元，為我國的流行性出血熱疫病防控起了重大作用，獲2000年度國家科技進(jìn)步一等獎。到2000年前后ZCLA建立了屏障系統(tǒng)核心群，完成開放與屏障兩個封閉生產(chǎn)群的生物學(xué)特性研究，獲2002～2003浙江省科技進(jìn)步獎和浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新獎。2003～2015年間又列入國家科技支撐計劃資助的特種實(shí)驗(yàn)動物保種試點(diǎn)(長爪沙鼠保種點(diǎn))。到目前為止，該封閉群已成為國內(nèi)保種維持時間最長、特性穩(wěn)定、應(yīng)用單位最多、使用量最大、其基本生物學(xué)特性研究較系統(tǒng)的第一個封閉群[1]。雖然前30年里該動物在實(shí)驗(yàn)動物領(lǐng)域取得一定成績，但隨著實(shí)驗(yàn)動物行業(yè)的成長，ZCLA長爪沙鼠在資源利用的深度、廣度方面還有待于進(jìn)一步提升。因此，為了提高其利用的科技含量，就需從其特有的性能出發(fā)，利用最新的技術(shù)對其深入的研究與定向選育。

1.2 NAFLD動物模型

全國血脂異常的人群大于1.6億，而確診為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的人數(shù)約占成人的20%[2]，因此研究NAFLD(高脂血癥)探索發(fā)病機(jī)理和篩選治療藥物是今后的一項(xiàng)長期工作。理想的NAFLD動物模型是研究工作獲得進(jìn)展與成功的前提之一[3]，包括具備人類NAFLD的特征，相對明顯的病程分期：單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，符合人類脂肪肝的演變過程；造模方法簡易，成模率高，死亡率低；造模停止后病變逆轉(zhuǎn)有一個過程，便于實(shí)施藥物干預(yù)試驗(yàn)。

目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室使用最多的是小鼠，但小鼠缺乏膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)，血清脂蛋白構(gòu)成(HDL-C占70%)、脂質(zhì)代謝過程與人類存在較大差異[4]。兔和豚鼠因是草食動物且血清HDL比例過高，脂類代謝的其他成份與人類相差大。金黃地鼠模型是易形成高TG血癥，但未見有NAFLD的報道[5]。大動物如猴、豬、犬等的病變與人類相似，但繁殖周期長，使用成本高。高脂誘導(dǎo)的禽類模型因脂代謝與人類差異大而僅在上個世紀(jì)用于早期脂肪肝研究。即使是目前最常用的大鼠也與人類有較大區(qū)別，血清HDL-C比例高達(dá)80%(人類只占30%)，血漿中CETP的活性僅為人類的14%，耐受高脂，極難形成肝纖維化，在連續(xù)高脂飼養(yǎng)48周以上才能形成NAFLD肝纖維化但存活率不足10%[6]，而CCL4誘發(fā)的大鼠肝纖維化無法連續(xù)觀察脂肪性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的動態(tài)過程。Hegsted等[7]、Sullivan等[8]及鐘民濤等[9]相繼證實(shí)沙鼠對高脂敏感且能維持高脂血癥。作者課題組自2005年來開始了長爪沙鼠高脂血癥的研究，建立了長爪沙鼠NAFLD模型[10]，特色是成模時間短(1～12周)、性狀典型(脂質(zhì)以LDL顆粒為主，血清游離膽固醇含量約占總含量30%左右，能形成單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，與人類NAFLD極為相似)、飼料配方簡便(不需要抑制甲狀腺藥物)。另外多年封閉的ZCLA老齡沙鼠有自發(fā)性高脂血癥現(xiàn)象，且存在家系及性別間的差異。因此有必要從三個方面對ZCLA長爪沙鼠進(jìn)行研究：一是模型的建立及檢測方法；二是特色評價，即成模的機(jī)理方面(誘發(fā)型快速成模與自發(fā)型成模)；三是對模型易感的遺傳學(xué)研究，以最終建立近交系為目的而進(jìn)行高效的遺傳標(biāo)記的篩選和評價。

2 研究目的

針對后基因組時代，長爪沙鼠也需要用新技術(shù)進(jìn)行深入研究才能可持續(xù)發(fā)展。目前使用的動物模型不同程度地存在著諸多缺陷，尋求與人類病程極為相似，方法簡便易行，成模率高并且在評價封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，能為近交系的選育確定遺傳標(biāo)記成為我們的主要目的。

本研究自行配制了簡便的飼料，首次建立快速成模的誘發(fā)型NAFLD模型，對于封閉群進(jìn)行長期的觀察，首次發(fā)現(xiàn)了老齡自發(fā)型模型，并采用臨床常用的血清電泳檢測技術(shù)對模型進(jìn)行分型與評價，同時建立了評價模型的腸道微生物的PCR-DGGE技術(shù)；其次用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對誘發(fā)型長爪沙鼠模型及自發(fā)型長爪沙鼠模型進(jìn)行深度測序，找出與長爪沙鼠快速成模及自發(fā)成模的一些高表達(dá)基因和差異顯著的pathways；第三，從經(jīng)典的理論與密切相關(guān)的基因出發(fā)，用候選基因法，免疫組化法預(yù)測功能來評定基因與沙鼠高脂血癥的相關(guān)性；最后，在ZCLA封閉群中取大樣本，涵蓋了兩個微生物等級的生產(chǎn)群，對選定的基因的SNP進(jìn)行遺傳多樣性評價，確定其作為NAFLD遺傳標(biāo)記進(jìn)行近交系選育的潛力。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

首次建立了長爪沙鼠NAFLD模型，闡明了長爪沙鼠肝臟脂肪快速沉積的特征，揭示了長爪沙鼠脂肪肝易感的分子機(jī)制、主要的調(diào)控靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)作用特征，為臨床治療及新藥研發(fā)提供一種背景相對清晰，耗時短的新型脂肪肝動物模型，同時也為NAFLD發(fā)病機(jī)制及藥效新靶點(diǎn)的研究提供依據(jù)和實(shí)驗(yàn)動物支撐，為選育近交系NAFLD長爪沙鼠奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

4 討論

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)模型目前采用比較多的做法是對常用的封閉群動物，引入高脂、高糖飲食法或化學(xué)肝損、藥物肝損等控制因素，使之形成脂肪肝，或采用改造基因組等辦法(即轉(zhuǎn)人源基因、自身基因敲除等形成的特定近交系)，但NAFLD的形成是多基因所致，很難歸咎于單基因異常，另外由于同時刪除兩個或兩個以上基因的動物模型在技術(shù)上操作難度大等一系列原因使其未能成為質(zhì)優(yōu)價廉的NAFLD動物模型。本研究促進(jìn)科技的作用表現(xiàn)在：利用高脂飼料誘導(dǎo)并建立了沙鼠NAFLD模型，用腸道微生物的特征來評價造模成功的方法，獲得了沙鼠模型基因轉(zhuǎn)錄水平的10個特色，初步闡明了其遺傳學(xué)基礎(chǔ)。同時結(jié)合老齡動物自發(fā)高脂血癥傾向，用候選基因法研究了APOE，LCAT兩個候選基因與長爪沙鼠高脂血癥(非酒精性肝病)的相關(guān)性，為將其作為培育近交系的遺傳標(biāo)記打下了基礎(chǔ)，這些均是在國外首次開展與報道。

[1] 劉月環(huán).長爪沙鼠β-防御素基因(defβ1-83)的克隆與鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(9):70-74.

[2] FAN JG,Farrell GC. Epidemiology of non-alciholic fatty liver disease in China[J]. J Hpeatol, 2009,50(1):204-210.

[3] Kris-Etherton PM,Dietschy J.Design criteria for studies examining individual fatty acid effects cardiovascular disease risk factors:human and animal studies [J]. Am J Clin Nutr, 1997, 65(suppl):1590S-1596S.

[4] Moghadasian MH, Frohlich JJ, McManus BM. Advances in experimental dyslipidemia and atherosclerosis[J].Lab Invest,2001, 81(9):1173-1183.

[5] 施新猷,顧為望.人類疾病動物模型[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008: 342-345.

[6] Temmerman AM, Vonk RJ, Niezen-Koning K,etal. Effects of dietary cholesterol in the Mongolian gerbil and the rat: a comparative study [J].Laboratory Animals,1997,23,30-35.

[7] Hegsted DM, Gailagher A.Dietary fat and cholesterol and serum cholesterol in the gerbil[J]. J Lipid Res,1967,8(3):210-214.

[8] Sullivan MP, Cerda JJ, Robbins FL,etal. The gerbil,Hamster,and Guinea pig as rodent models for hyperlipidemia[J].Lab Anim Sci,1993,43(6):575-578.

[9] 鐘民濤, 王迎, 盧靜, 等.長爪沙鼠的高脂血癥與動脈粥樣硬化相關(guān)性分析[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(6):321-324.

[10] 徐黎明, 石巧娟, 徐磊, 等.蒙古沙鼠非酒精性脂肪性肝病模型的建立與評價[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,19(11):1-2, 7.

Preliminarily genetic characterizations of nonalcoholic fatty liver disease mongolian gerbil

LIU Yue-huan1, WU Jiu-sheng2, YING Hua-zhong1, XU Cheng-fu2,SHI Qiao-juan1, YU Chen-huan1

(1.Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,China;2.Zhejiang university,Hangzhou 310058)

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has become one of the major metabolic diseases. In view of the defects of traditional animal models, this study was the first to establish the NAFLD model of Mongolian gerbil (Merionesunguiculatus) with simple feed formula which is similar to human (from simple fatty liver to steatohepatitis, fibrosis，Liver cirrhosis). This study discussed the mechanism of rapid fatty liver deposition in Mongolian gerbil, revealed its molecular mechanism,main regulatory target and network function of fatty liver susceptibility. We provide a new animal model of NAFLD with relatively clear background and less time-consuming for clinical treatment and new drug development. The theoretical and practical basis for the breeding of inbred strain NAFLD gerbil was established.

Nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD); Mongolian gerbil; Genetic Characterizations

浙江省自然科學(xué)基金(Y3080126，Y3110366，LY16H030011);浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2011C37096，2015C37102);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺重點(diǎn)項(xiàng)目(2011ZDA002);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生優(yōu)秀青年人才基金(2007QN001);浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才基金(A80703Q)。

劉月環(huán)，女，(1974-)，博士后，副研究員，研究方向：生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物模型。E-mail:yuehuanliu@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0009-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.004

2016-12-30