SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠CD4+Th細胞分化及炎癥細胞因子表達的影響及機制研究

張 沛,董念國,劉金平△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸心外科 400010；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 410030)

SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠CD4+Th細胞分化及炎癥細胞因子表達的影響及機制研究

目的 觀察SOCS3基因?qū)π∈驝D4+Th細胞分化及細胞因子表達的影響。方法 分離、培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染小鼠CD4+Th細胞，以植物血凝素(PHA)刺激靶細胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測相應(yīng)細胞因子基因表達；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測目的細胞因子蛋白表達。結(jié)果 與對照組相比較，轉(zhuǎn)染組T-bet、白細胞介素(IL)-2、干擾素-γ(IFN-γ)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)4、IL-12Rβ2基因表達明顯下調(diào)，細胞因子信號抑制物(SOCS)3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因表達明顯上調(diào)，T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2蛋白表達明顯下調(diào)，SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6蛋白表達明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 SOCS3基因轉(zhuǎn)染可上調(diào)小鼠CD4+Th細胞SOCS3基因表達，下調(diào)STAT4活化和磷酸化，抑制Th1細胞分化，并下調(diào)炎癥細胞因子基因和蛋白表達，同時間接促進Th2細胞分化，并上調(diào)相應(yīng)炎癥細胞因子基因和蛋白表達。

T淋巴細胞，輔助誘導(dǎo)；細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制因子；細胞分化；細胞因子類

移植物血管病(CAV)的典型病理表現(xiàn)是移植物內(nèi)血管內(nèi)膜增生，引起彌漫性和向心性的冠狀動脈狹窄，最終導(dǎo)致移植物缺血和失功能。在移植物內(nèi)局部浸潤的炎癥細胞及其所表達的炎性細胞因子、生長因子是調(diào)控內(nèi)膜增生的重要因素[1]。而在這些炎癥細胞中，Th1細胞及其所表達的細胞因子，對內(nèi)膜增生最為重要。因此，Th1細胞是對移植物血管病研究中的重要靶細胞[2]。

細胞因子信號抑制物(SOCS)蛋白家族具有廣泛的功能和復(fù)雜的調(diào)控機制，SOCS3作為其中功能最強大的一員，通過調(diào)控細胞因子和激素表達，可以對多種疾病產(chǎn)生調(diào)控作用[3]。目前認為，由于SOCS3蛋白功能強大，可以調(diào)節(jié)多條信號通路，在疾病進程中，能夠通過不同的信號通路協(xié)作或拮抗性地調(diào)節(jié)同一目的信號因子或靶細胞，因此，研究中有時會得到與預(yù)期不符的效果[4]。但是，SOCS3基因?qū)h細胞的作用和機制尚不明確，本實驗利用植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激誘導(dǎo)小鼠脾臟來源CD4+Th細胞分化，觀察重組小鼠SOCS3基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染對其分化和炎癥細胞因子表達的影響。利用該體外實驗，進一步研究移植物血管病中SOCS3對Th細胞分化的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 8周大雄性SPF級C57BL/6小鼠(H-2b)購于武漢大學(xué)動物實驗中心。小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體由(蘇州)賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建，行空斑形成實驗，檢測鑒定病毒滴度為1×1010pfu/mL。磁珠分選裝置及CD4+Th細胞磁珠分選試劑盒購于德國Miltenyi Biotec公司。SOCS3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)4、P-STAT4抗體購于美國Bioworlde公司，干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-2抗體購于美國Santa Cruz公司，重組抗小鼠IL-4抗體、FITC-抗小鼠CD4抗體、FITC-抗小鼠IFN-γ抗體、FITC-抗小鼠GATA-3抗體、重組小鼠IL-12購于加拿大eBiosience公司。PHA購于美國sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成、測序均由南京金斯瑞生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟CD4+Th細胞原代培養(yǎng) 90只C57BL/6小鼠隨機分為3個組：對照組、Ad-SOCS3組、Ad-GFP組，每組30只。脫頸椎法處死小鼠，無菌獲取C57BL/6小鼠脾臟，制成單個細胞懸液。加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至總體積2 mL，加入同等體積的淋巴細胞分離液，以密度梯度離心法2 000 r/min條件下離心15 min，RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，加CD4微珠，混勻，2～8 ℃避光孵育15 min，洗滌后，PBS重懸，將細胞置入事先用RPMI 1640培養(yǎng)基潤洗過的MS柱中，收集MS柱吸附的細胞，即為CD4+細胞。

1.2.2 小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染小鼠脾臟CD4+Th細胞 以無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，使待轉(zhuǎn)染細胞同步化。收集細胞懸液，1 000 r/min條件下離心10 min，調(diào)整細胞濃度為2×106/mL。2×105/孔接種于12孔細胞培養(yǎng)板。每孔中加入含10%胎牛血清(FBS) RPMI 1640培養(yǎng)基1 mL，同時加入不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的Ad-SOCS3，然后在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后，收集細胞懸液，1 000 r/min條件下離心10 min，重懸，加入10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)。分別在不同時點于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，觀察不同MOI和不同時間點的Ad-SOCS3對小鼠脾臟CD4+Th細胞轉(zhuǎn)染效果的影響。

1.2.3 細胞制備及轉(zhuǎn)染 根據(jù)實驗分組，在Ad-SOCS3組、Ad-GFP組和對照組中，根據(jù)上一步實驗結(jié)果所得出的最佳MOI值及最佳轉(zhuǎn)染時間，分別照上一步方法轉(zhuǎn)染Ad-SOCS3、Ad-GFP和100 μL無菌PBS，熒光顯微鏡下直接觀察細胞感染效率，并用于后續(xù)部分實驗。

1.2.4 小鼠脾臟CD4+Th細胞的體外誘導(dǎo)分化 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞成功后，在3組細胞培養(yǎng)瓶中，分別加入濃度10 μg/mL的PHA，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，刺激誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+Th向Th1型細胞分化。收集細胞懸液，離心，棄上清液，得到分化后的CD4+Th細胞，用于下一步檢測。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 檢測Ad-SOCS3、Ad-GFP和100 μL無菌PBS干預(yù)后，各組小鼠脾臟CD4+Th細胞 SOCS3 mRNA表達，以及體外誘導(dǎo)Th分化后的小鼠脾臟CD4+Th細胞的SOCS3、STAT4、IFN-γ、IL-2 mRNA表達。

1.2.6 Western blot 檢測各組體外誘導(dǎo)分化后的小鼠脾臟CD4+Th細胞的SOCS3、STAT4、P-STAT4、IFN-γ、IL-2蛋白表達。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠脾臟CD4+Th細胞的獲取及鑒定 成功獲取小鼠脾臟CD4+Th細胞，細胞形態(tài)多為圓形，懸浮生長，隨培養(yǎng)時間延長，可聚攏呈團塊狀生長，流式細胞學(xué)檢測證實為CD4+Th細胞,且純度大于95%，適用于后續(xù)實驗。

2.2 腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠脾臟CD4+Th細胞的條件 轉(zhuǎn)染后不同時間點，熒光顯微鏡下分別觀察各組不同MOI值轉(zhuǎn)染效果。其中MOI=160轉(zhuǎn)染細胞組，轉(zhuǎn)染72h后，轉(zhuǎn)染效果佳，熒光顯微鏡下觀察見90%以上的小鼠脾臟CD4+Th細胞均表達綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率高，滿足后續(xù)實驗要求。后續(xù)實驗即按照MOI為160感染小鼠脾臟CD4+Th細胞72h條件進行。

2.3 重組腺病毒感染小鼠脾臟CD4+Th細胞效率 分別將感染復(fù)數(shù)MOI為160的Ad-SdCS3及Ad-GFP感染小鼠脾臟CD4+Th細胞,10%FBSRPMI1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)72h。熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光信號的細胞數(shù)占細胞總數(shù)90%以上,說明小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體感染效率高。見圖1、2。

圖1 光鏡下小鼠CD4+Th細胞(×200)

圖2 熒光顯微鏡下小鼠CD4+Th細胞轉(zhuǎn)染效果圖(×200)

2.4 各組小鼠CD4+Th細胞SOCS3mRNA表達Ad-SOCS3組SOCS3mRNA表達較Ad-GFP組及對照組明顯上調(diào)(P<0.01),而Ad-GFP組與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖3。

2.5SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠脾臟CD4+Th細胞各種炎癥細胞因子mRNA表達的影響 與對照組和Ad-GFP組相比較，Ad-SOCS3組T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2基因表達明顯下調(diào)(P<0.01)，SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因表達明顯上調(diào)(P<0.01)。Ad-GFP組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

2.6SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠脾臟CD4+Th細胞各種炎癥細胞因子蛋白表達的影響Ad-SOCS3組與對照組比較，T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2蛋白表達明顯下調(diào)，SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6蛋白表達明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ad-GFP組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

*：P<0.05，與對照組、Ad-GFP組比較。

圖3 各組SOCS3mRNA表達

圖4 各組小鼠脾臟CD4+Th細胞中炎癥因子mRNA相對表達量

1：Ad-SOCS3組；2：Ad-GFP組；3：對照組。

圖5 各組小鼠脾臟CD4+Th細胞中炎癥因子蛋白表達

3 討 論

Th細胞是機體中一類重要的免疫細胞，其正常功能表達依賴它在免疫器官內(nèi)或作用靶點的外周分化的正常進行。本實驗利用PHA刺激誘導(dǎo)小鼠脾臟來源CD4+Th細胞分化，觀察重組小鼠SOCS3基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染對其分化和炎癥細胞因子表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟來源CD4+Th細胞內(nèi)SOCS3基因過表達，可抑制其在促炎因素誘導(dǎo)下的Th1型炎癥因子表達，與此同時，上調(diào)Th2型炎癥因子表達。

在抗原刺激、細胞因子等微環(huán)境的協(xié)同作用下，CD4+Th細胞可分化成為不同的亞群以發(fā)揮特定的生理學(xué)作用[5]。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細胞因子，介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，在對抗病原體、腫瘤中起重要作用[6]。自然殺傷細胞表達的IFN-γ和抗原呈遞細胞(APCs)表達的IL-27可激活信號通路STAT1，APCs表達的IL-12可激活信號通路STAT4，以上3種途徑，可以分別啟動Th1細胞分化。其中前兩條途徑，主要通過上調(diào)IFN-γ表達，使Th1細胞分化隨細胞數(shù)量增加而穩(wěn)定保持。后一條途徑，一方面通過上調(diào)IFN-γ表達，保持Th1細胞分化數(shù)量，另一方面可以通過抑制IL-4負向調(diào)節(jié)Th2細胞分化，維持Th1細胞分化的方向[7]。在本實驗中，利用PHA刺激誘導(dǎo)小鼠脾臟來源CD4+Th細胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-bet、IL-2和IFN-γ表達增加，說明該條件下，CD4+Th細胞向Th1細胞分化。同時，STAT4和IL-12Rβ2基因和蛋白表達均增加，磷酸化上調(diào)，說明IL-12/STAT4信號通路在極化過程中被激活，并發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

SOCS蛋白是先天和獲得性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的生理性調(diào)節(jié)物質(zhì)[8]。SOCS家族成員廣泛參與并調(diào)節(jié)了Th細胞的分化，以及干預(yù)炎癥因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)的程度，從而在免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[9]。其中SOCS3的調(diào)節(jié)功能與Th細胞分化關(guān)系密切。在胸腺細胞發(fā)育的最早階段，也就是其分化成為不同T細胞受體表型的階段，SOCS3即有表達[10]。而此時在選擇性敲除SOCS3基因動物模型中，會發(fā)現(xiàn)不同亞群T細胞比例改變。而在這之后，T細胞發(fā)育的多個階段中，SOCS3都高水平表達，尤其在CD4+、CD8+Th細胞中，有著相對更高的表達量[11]。本實驗中，利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠脾臟來源CD4+Th細胞，使SOCS3過表達，可下調(diào)STAT4基因和蛋白表達，抑制其磷酸化，從而抑制Th1分化中IL-12/STAT4信號通路活性，負向調(diào)節(jié)Th1細胞分化，繼而降低IFN-γ、IL-2等細胞因子表達水平。因為SOCS3不能直接調(diào)節(jié)STAT4信號通路，而STAT4通路活性下調(diào)在實驗中被觀察到，筆者認為SOCS3通過間接抑制STAT4通路活性作用達到這一效果。

Th2細胞是另一種重要的T細胞亞群。其主要表達IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10等細胞因子，主要在機體內(nèi)參與體液免疫的調(diào)節(jié)作用[12]。Th2細胞分化主要通過STAT6通路調(diào)控，而SOCS3基因不能直接作用該通路，因此，SOCS3基因不能直接調(diào)控Th2分化。但是在Th細胞分化過程中，Th1/Th2細胞亞群可以通過各自表達的細胞因子相互作用，產(chǎn)生競爭和抑制的關(guān)系。Th1細胞特異性表達的IFN-γ、IL-2可抑制Th2細胞的增殖和功能，而同樣Th2細胞表達的IL-4和IL-10也可以抑制Th1細胞分化。外源性增加SOCS3基因表達，通過作用于IL-12/STAT4通路，減弱Th1細胞分化作用，使IFN-γ、T-bet、IL-2等細胞因子表達下調(diào)，從而間接性減弱了對Th2分化的抑制作用。一定程度上促進了Th2細胞分化。本實驗中，Th2細胞亞群活化通路STAT6及特異性細胞因子GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10表達上調(diào)，證實了這一結(jié)論。而Th2細胞分化增強，IL-4、IL-10細胞因子表達上調(diào)，又可以進一步抑制Th1細胞分化。最終達到調(diào)節(jié)Th1/Th2亞群比例的效果。在本研究中，外源性增加SOCS3基因表達，導(dǎo)致的IFN-γ、IL-2下調(diào)和IL-4、IL-10上調(diào)，均對抑制炎癥反應(yīng)和CAV進程起到了關(guān)鍵作用，對術(shù)后排斥反應(yīng)起到了保護作用。

本實驗證明腺病毒載體介導(dǎo)的供體SOCS3基因轉(zhuǎn)染能夠通過調(diào)控Th1/Th2細胞分化，抑制其促炎功能。在該研究方向上繼續(xù)深入挖掘，可能會獲得更多信息。進一步明確SOCS3對移植物血管病的影響和機制，可能會在慢性排斥反應(yīng)的治療方面取得新的突破口。

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The effects and mechanism of SOCS3 gene transfection in CD4+Th cell differentiation and expression of inflammatory cytokines of mouse*

ZhangPei1,DongNianguo2,LiuJinping2△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;2.DepartmentofCardiovascularSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei410030,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of adenovirus vector mediated SOCS3 gene transfection in CD4+Th cell differentiation and expression of inflammatory cytokines of mouse.Methods The CD4+Th cells were isolated from spleen of C57bl/6 mouse and cultured.Ad-SOCS3 were transfected into the CD4+Th cells.PHA was used for culturing with the CD4+Th cells.RT-PCR were used to detect the mRNA expression,and Western blot were used to detect the protein expression of cytokines.Results Compared with the control group,the gene and protein expression of T-bet,IL-2,IFN-γ,STAT4 and IL-12Rβ2 in the transfected group were significantly down-regulated,the gene and protein expression of SOCS3,GATA-3,IL-4,IL-6,IL-10 and STAT6 were significantly up-regulated(P<0.01).Conclusion The results indicate that SOCS3 gene transfection can up-regulate SOCS3 mRNA and protein expression in the CD4+Th cells,down-regulate the JAK/STAT pathway,inhibition of Th1 cell differentiation,and down regulation of inflammatory cytokine gene and protein expression,and indirectly promote Th2 cell differentiation,and up the corresponding inflammatory cytokine gene and protein expression.

T-lymphocytes,helper-inducer;suppressor of cytokine signaling proteins;cell differentiation;cytokines

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.003

國家自然科學(xué)基金資助項目(81270322)。 作者簡介：張沛(1982-)，主治醫(yī)師，講師，博士，主要從事心臟移植研究。△

張 沛1,董念國2,劉金平2△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸心外科 400010；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 410030)

R392.4

A

1671-8348(2016)36-5049-03

2016-07-18

2016-09-06)