補腎強身膠囊微生物限度方法的研究及相關(guān)市場質(zhì)量考查

閻雅寧

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

補腎強身膠囊微生物限度方法的研究及相關(guān)市場質(zhì)量考查

閻雅寧

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立補腎強身膠囊微生物限度檢查方法，進行方法適用性試驗，并對抽取的143批樣品進行微生物限度檢查。方法：細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌和酵母菌采用平皿法；大腸埃希菌和大腸菌群采用常規(guī)法。結(jié)果：稀釋法可有效去除補腎強身膠囊的抑菌作用，使各試驗菌的加菌回收率均符合《中國藥典》要求。結(jié)論：補腎強身膠囊可按照此方法進行微生物限度檢查。抽驗143批次結(jié)果均符合規(guī)定。

國家評價性抽驗，補腎強身膠囊，方法學驗證試驗

2015年國家對143批補腎強身膠囊進行了評價性抽驗。補腎強身膠囊為中藥成方制劑，處方中含有金櫻子、菟絲子、淫羊藿、狗脊(制)、女貞子(制)等中藥成分，為口服膠囊制劑，每粒裝0.3 g，內(nèi)容物為棕色或棕褐色的粉末，味微酸[1]。該品種臨床上主要用于治療頭暈耳鳴、腰膝酸軟、眼花心悸、陽痿遺精等癥狀。按照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法的要求,建立補腎強身膠囊的微生物限度檢查方法并對其加以驗證[2]，用選定方法對抽取的143批樣品進行微生物限度檢查，方法可行，并對此次評價抽驗情況及結(jié)果進行匯總和質(zhì)量分析。

1 試驗材料

1.1 培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號1404082)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號140313)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)(批號1404112)購自北京三藥科技開發(fā)公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號140819)、4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(批號20131114)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號051021)購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液自配。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢桿(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]、白色念珠菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(F) 98001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]均購自中國食品藥品檢定研究院，由本所傳代保存。

1.3 樣品 此次國家評價性抽驗共抽取24個生產(chǎn)廠家的143批補腎強身膠囊，對廣東羅浮山國藥股份有限公司(批號L15E022)、太極集團四川綿陽制藥有限公司(批號1501001)和陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司(批號20150102)三個廠家的樣品進行了微生物限度檢查方法學的驗證，并對143批藥品進行了微生物限度的檢查。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗菌液的制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌三種細菌的新鮮培養(yǎng)物少許，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h。取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，以10倍稀釋至約10-5～10-7，混勻備用。

2.1.2 白色念珠菌 取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h。取該培養(yǎng)物1 ml，加9 ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，以10倍稀釋至約10-5～10-7，混勻備用。

2.1.3 黑曲霉 將黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，使大量孢子成熟。取該培養(yǎng)物加0.9%無菌氯化鈉溶液4 ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空無菌試管作為原菌液，以10倍稀釋至約10-4～10-5，混勻備用。各試驗菌菌液濃度每1 ml含10～100 cfu。

2.2 供試品溶液的制備 選取廣東羅浮山國藥股份有限公司的樣品，稱取樣品10 g,加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，作為1∶10供試液。

2.3 菌落計數(shù)方法驗證的預試驗

2.3.1 常規(guī)平皿法 取1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌(約10～100 cfu)至平皿，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。同法分別取1∶10供試液1 ml和規(guī)定量的白色念珠菌及黑曲霉至平皿，立即傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基。含每種菌的供試液各制備兩個平行平皿。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10供試液1 ml等量分注2皿，每皿0.5 ml，分別加入規(guī)定量試驗菌(約50～100 cfu)，立即傾注相應的培養(yǎng)基。取1∶10供試液1 ml等量分注5皿，每皿0.2 ml，分別加入規(guī)定量試驗菌(約50～100 cfu)，立即傾注相應的培養(yǎng)基。取1∶10供試液1 ml等量分注10皿，每皿0.1 ml，分別加入規(guī)定量試驗菌(約50～100 cfu)，立即傾注相應的培養(yǎng)基。

2.4 預試驗結(jié)果 平皿法和稀釋法回收率結(jié)果見表1。根據(jù)試驗結(jié)果,采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法(0.5 ml/皿和0.2 ml/皿)，枯草芽孢桿菌的回收率都小于70%, 說明該品種對細菌有一定的抑菌作用,采用培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿)能充分去除本品中的抑菌成分, 而對真菌沒有抑制，可以用于補腎強身膠囊的細菌檢查，平皿法可用于霉菌及酵母菌數(shù)的檢查。

表1 平皿法和稀釋法回收率結(jié)果

2.5 細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測定方法的驗證 選取三個廠家：廣東羅浮山國藥股份有限公司、太極集團四川綿陽制藥有限公司和陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司的樣品,細菌按培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿)、霉菌及酵母菌按平皿法進行驗證試驗, 結(jié)果見表2。通過對三個廠家的驗證試驗結(jié)果表明，補腎強身膠囊的方法學驗證試驗結(jié)果為細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿)，霉菌和酵母菌計數(shù)采用平皿法，方法可行。

表2 試驗組各菌株回收率測定結(jié)果

2.6 控制菌檢查方法的驗證

2.6.1 大腸埃希菌檢查方法的驗證

2.6.1.1 試驗組 取1∶10的供試液10 ml和規(guī)定量大腸埃希菌(約10～100 cfu)加入到100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.6.1.2 陽性對照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌(約10～100 cfu)，加入到100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.6.1.3 大腸埃希菌試驗 試驗組和陽性對照組的培養(yǎng)基均渾濁，取上述培養(yǎng)物各0.2 ml，分別接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5 h和24 h在366 nm紫外光下觀察，然后再進行靛基質(zhì)試驗。結(jié)果見表3。

表3 大腸埃希菌試驗結(jié)果

2.6.2 大腸菌群檢查方法驗證

2.6.2.1 試驗組 取1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量大腸埃希菌(約10～100 cfu)加入到10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.6.2.2 陽性對照菌 取規(guī)定量大腸埃希菌(約10～100 cfu)，加入到10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.6.2.3 大腸菌群試驗結(jié)果 結(jié)果見表4。

表4 大腸菌群試驗結(jié)果

2.7 143批抽驗樣品微生物限度檢查結(jié)果 結(jié)果見表5。

表5 抽驗結(jié)果

3 討論

3.1 補腎強身膠囊為中藥成方制劑，其中所含有的一些成分會對細菌有一定的抑制作用，常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法(0.5 ml/皿和0.2 ml/皿)的細菌回收率都不能達到70%，均不能起到消除抑菌作用的目的。最后通過對3個廠家的3批樣品的驗證試驗確定培養(yǎng)基稀釋法(0.1 ml/皿)為細菌計數(shù)的方法，該方法能夠有效去除對細菌的抑制作用；采用平皿法對霉菌和酵母菌數(shù)進行測定,回收率大于70%；控制菌檢查(大腸埃希菌和大腸菌群)按常規(guī)法進行,符合《中國藥典》的規(guī)定,在一定的程度上保證了微生物限度檢查方法的科學有效，為補腎強身膠囊的質(zhì)量標準制定提供了切實有效的保證。

3.2 本次抽樣來源于17個省、自治區(qū)以及直轄市，從北方到南方，從西部到東部，涉及到24個生產(chǎn)企業(yè),127個流通領(lǐng)域，基本涵蓋了全國補腎強身膠囊的主要生產(chǎn)地和生產(chǎn)企業(yè)。因此，對其進行檢驗和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應該能較好地反映目前國產(chǎn)補腎強身膠囊的質(zhì)量現(xiàn)狀和市場情況。在執(zhí)行標準方面，其中131批次執(zhí)行標準為《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第四冊》,4批次執(zhí)行《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準》YBZ09362004，4批次執(zhí)行《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準》WS3-B-0751-91-5，2批次執(zhí)行《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準》WS3-B-0751-91-4，1批次執(zhí)行《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)》YBZ10592004，1批次執(zhí)行《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)》YBZ22522005。各標準的微生物限度檢查方法均參照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法的要求,根據(jù)各自的執(zhí)行標準進行微生物限度檢查，結(jié)果為：細菌數(shù)均小于10 cfu/g，霉菌和酵母菌數(shù)均小于10 cfu/g，大腸埃希菌均未檢出，大腸菌群均小于10個/g，結(jié)果均符合規(guī)定，合格率為100%。此次抽驗結(jié)果說明該中藥品種在流通運輸?shù)拳h(huán)節(jié)穩(wěn)定可靠，抽驗的生產(chǎn)企業(yè)對該藥品的原料采集、制備、工藝和生產(chǎn)等環(huán)節(jié)及藥品的質(zhì)量安全方面相對穩(wěn)定。

1 王敏．藥品評價性抽驗的作用與意義[J]．海峽藥學，2007，19(6):133-134

2 中國藥典[S].一部.2010：附錄79-88

2016-07-13

R927.1

A

1006-5687(2016)06-0021-03