丹皮酚和三七總皂苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的影響

范彥芳，李前寬，周曉慧，曹 凱

(承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

丹皮酚和三七總皂苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的影響

范彥芳，李前寬，周曉慧，曹 凱*

(承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

目的：探討丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)的影響。方法：結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備急性心肌梗死大鼠動(dòng)物模型；將存活且造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型組、丹皮酚組、三七總皂苷組、丹皮酚與三七總皂苷聯(lián)合用藥低劑量組、高劑量組和卡托普利組，另立假手術(shù)組。連續(xù)給藥4周，Masson染色檢測(cè)各心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，Western-blot檢測(cè)心肌組織中TNF-α蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，各用藥組CVF和TNF-α蛋白表達(dá)不同程度降低；與單味藥丹皮酚組和三七總皂苷組比較，聯(lián)合用藥組CVF和TNF-α蛋白表達(dá)下調(diào)顯著，聯(lián)合用藥高劑量組較聯(lián)合用藥低劑量組作用更顯著。結(jié)論：丹皮酚與三七總皂苷聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同下調(diào)TNF-α蛋白表達(dá)，改善心室重構(gòu)。

丹皮酚，三七總皂苷，聯(lián)合用藥，心室重構(gòu)，TNF-α

心室重構(gòu)是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后心肌組織的基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)、代謝及功能發(fā)生模式上的改變重建的一個(gè)過(guò)程，包括心肌細(xì)胞的肥厚、長(zhǎng)寬比例發(fā)生變化，收縮功能下降，逐漸變性和壞死，心肌間質(zhì)發(fā)生纖維化，細(xì)胞外基質(zhì)膠原網(wǎng)的量和質(zhì)的改變。此病理改變是導(dǎo)致慢性心衰的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1，2]。因此，抑制心梗后的心室重構(gòu)可抑制或延緩心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。丹皮酚(paeonol，Pae)從中藥蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿和毛茛科植物牡丹的莖和根皮中分離而來(lái)，有抗炎、抗心律失常、保護(hù)心血管等藥理作用[3]。三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是五加科植物三七的主要有效成分，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病[4]。本研究旨在確證二者聯(lián)合應(yīng)用是否能夠協(xié)同影響TNF-α的表達(dá)，改善心梗后心室重構(gòu)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g(北京維通利華，許可證號(hào)SCXK[京]2012-0001)。丹皮酚注射液(天真制藥，批號(hào)20110603)；血塞通注射液(成分是三七總皂苷，昆明制藥，批號(hào)13CJ27)；卡托普利片(開(kāi)封制藥，批號(hào)H41022498)；Masson染色試劑盒(福州邁新)；β-action、TNF-α蛋白抗體(美國(guó)Santa cruze公司)。小型動(dòng)物呼吸機(jī)(淮北正華，DW3000-B)，電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng)，DYY-BC)。

1.2 方法

1.2.1 AMI模型制備及分組 80只SD大鼠中隨機(jī)選取10只，穿線(xiàn)不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支為假手術(shù)組。剩余70只結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支制備AMI模型，心電圖顯示ST段呈弓背向上型抬高至少1/2，標(biāo)志AMI模型建立成功[5]。手術(shù)3 d后，將成模大鼠隨機(jī)分成丹皮酚組(腹腔注射8 mg/kg)、三七總皂苷組(腹腔注射40 mg/kg)、聯(lián)合低劑量組(腹腔注射丹皮酚4 mg/kg +三七總皂苷20 mg/kg)、聯(lián)合高劑量組(腹腔注射丹皮酚8 mg/kg +三七總皂苷40 mg/kg)、卡托普利組(10 mg/kg灌胃)、模型組和假手術(shù)組(腹腔注射等體積生理鹽水)。1次/d，連續(xù)給藥28 d取材。水合氯醛(4%)腹腔麻醉大鼠，快速開(kāi)胸取出心臟，切取梗死心臟組織一部分固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，常規(guī)石蠟脫水包埋，制成蠟塊，以備形態(tài)學(xué)的觀(guān)察；另一部分凍存于-80 ℃冰箱中，以備Western-blot蛋白表達(dá)的測(cè)定。

1.2.2 Masson染色 取心臟橫切面4 μm連續(xù)切片5張，染色步驟參照Masson染色試劑盒所附說(shuō)明書(shū)，染色時(shí)間適當(dāng)調(diào)整。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)膠原纖維藍(lán)染，肌肉紅染。每張石蠟切片200倍顯微鏡下隨機(jī)選取觀(guān)察5個(gè)視野拍照后采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定CVF[CVF=膠原面積/(心肌面積+膠原面積)]，觀(guān)察各組心肌纖維化程度。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)TNF-α 蛋白表達(dá) 在低溫環(huán)境中，提取心肌組織總蛋白，BCA法進(jìn)行含量測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并推導(dǎo)演算蛋白濃度，計(jì)算上樣量，95 ℃水浴5 min蛋白變性。12%SDS-PAGE凝膠穩(wěn)壓電泳，冰中130 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉和TBST混合液4 ℃封閉過(guò)夜。次日室溫?fù)u床上一抗孵育2 h，TBST洗膜15 min/次，3次；二抗孵育2 h，TBST洗膜5 min/次，3次；暗室中避光顯影、定影。用Quantity One軟件掃描目的蛋白和β-action條帶的灰度值，用其比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Masson染色結(jié)果 對(duì)照假手術(shù)組，模型組膠原纖維結(jié)締組織嚴(yán)重增生成網(wǎng)狀，排布紊亂，大量纖維瘢痕形成，CVF值明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組的病理改變均有不同程度的改善，巨檢均無(wú)大量膠原纖維網(wǎng)和瘢痕，CVF值不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)其中聯(lián)合高劑量組最明顯。見(jiàn)圖1和表1。

A.假手術(shù)組 B.模型組 C.卡托普利組 D.Pae組 E.PNS組 F.聯(lián)合高劑量組 G.聯(lián)合低劑量組圖1 Massom染色(×200)

2.2 大鼠心肌組織TNF-α 蛋白的表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α 蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組蛋白的表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)；聯(lián)合用藥組較丹皮酚和三七總皂苷單味給藥組降低顯著(P<0.01)；聯(lián)合高劑量組較聯(lián)合低劑量組降低更加明顯(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。

A.假手術(shù)組 B.模型組 C.卡托普利組 D.Pae組 E.PNS組 F.聯(lián)合高劑量組 G.聯(lián)合低劑量組圖2 各組大鼠心肌中TNF-α 的蛋白表達(dá)表1 各組大鼠心肌中 CVF和TNF-α 蛋白的表達(dá)

組別動(dòng)物數(shù)CVF(%)TNF-α蛋白表達(dá)假手術(shù)1014．75±4．930．93±0．03模型845．96±8．32a2．13±0．10a卡托普利920．57±5．29b1．06±0．05bPae934．13±3．54b1．79±0．02bPNS931．45±3．54b1．67±0．04b聯(lián)合高劑量919．82±4．57bcef1．20±0．05bceg聯(lián)合低劑量927．41±5．36bcd1．57±0．04bce

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與Pae比較，cP<0.01；與PNS比較，dP<0.05，eP<0.01；與聯(lián)合低劑量比較，fP<0.05，gP<0.01。

3 討論

近年調(diào)查顯示心肌梗死的發(fā)病率一路攀升，嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的健康。心室重構(gòu)是心肌梗死發(fā)生后，心臟自身為保持有效心功能而產(chǎn)生的代償反應(yīng)，為修復(fù)已發(fā)生的病理改變使心室壁形態(tài)結(jié)構(gòu)改建的過(guò)程。但持續(xù)的心室重構(gòu)會(huì)使心室壁進(jìn)行性擴(kuò)張，功能逐漸衰退，是導(dǎo)致心力衰竭而致死亡的主導(dǎo)原因[6]。AMI后心室重構(gòu)的病理機(jī)制復(fù)雜多元，研究表明，炎癥信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、SNS和RAAS都與心室重構(gòu)的發(fā)生密切相關(guān)。其中炎癥通路的激活進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子過(guò)量表達(dá)是心室重構(gòu)發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制。因此，減輕炎癥細(xì)胞因子對(duì)心功能的損害顯得尤其重要[7]。

TNF-α 是常見(jiàn)的炎性細(xì)胞因子，有研究顯示AMI后，TNF-α 可通過(guò)NF-κB 炎癥途徑激活表達(dá)量增加，過(guò)量的TNF-α 又進(jìn)一步上調(diào)NF-кB的靶基因促進(jìn)其活化，進(jìn)而形成細(xì)胞因子激活的正反饋通路和惡性循環(huán)。抑制心肌收縮，促進(jìn)膠原的分泌和成纖維細(xì)胞的增殖，加速心室重塑。導(dǎo)致心力衰竭，抑制TNF-α 的表達(dá)，能夠減緩心室重構(gòu)的發(fā)展[8，9]。

本研究結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)大鼠AMI后心肌發(fā)生了纖維化，組織壞死嚴(yán)重，細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維沉積，TNF-α 表達(dá)明顯升高。各用藥組同模型組相比，心肌組織壞死有明顯減輕，CVF明顯降低，TNF-α 表達(dá)量顯著減少?？梢?jiàn)，丹皮酚和三七總皂苷均可改善心肌梗死后的心室重構(gòu)，分子機(jī)制可能與下調(diào)TNF-α 蛋白表達(dá)有關(guān)。且與單味藥相比較，聯(lián)合用藥組效果更顯著，且聯(lián)合高劑量組效果優(yōu)于低劑量組，兩藥合用協(xié)同作用明顯呈現(xiàn)。

1 Sutton M G, Sharpe N. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy[J]. Circulation, 2000, 101(25):2981-2988

2 Jessup M, Brozena S. Heart failure[J]. N Engl J Med，2003, 348(20): 2007- 2018

3 胡云飛,徐國(guó)兵.牡丹皮及其主要成分丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥, 2014, 18(4):589-592

4 武雙,崔秀明,郭從亮,等.三七“生打熟補(bǔ)”物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(8):50-53

5 Cheng K, Malliaras K, Shen D,etal. Intramyocardial injection of platelet gel promotes endogenous repair and augments cardiac function in rats with myocardial infarction[J]. Am Coll Cardiol, 2012, 59(3): 256-264

6 周曉慧,趙靜怡,張樹(shù)峰,等.丹皮酚通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)MMP-9的表達(dá)改善心梗后大鼠的心室重構(gòu)[J].中成藥,2014,36(12):2599-2602

7 Parish R C, Evans J D. Inflammation in chornic heart failure[J]. Ann Pharmacother, 2008, 42(7):1002-1016

8 Gurantz D, Cowling R T, Varki N,etal. IL-1beta and TNF-alpha up regulate angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) receptors on cardiac fibroblasts and are associated with increased AT1 density in the post-MI heart[J]. Mol Cell Cardiol, 2005, 38(3): 505-515

9 Monaco C, Andreakos E, Kiriakidis S,etal. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004, 101(15): 5634-5639

Effects of paeonol combined with PNS on TNF-αexpression in rats with ventricular remodeling after myocardial infarction

Fan Yanfang, Li Qiankuan, Zhou Xiaohui,Cao Kai

(Chengde Medical College，Chengde 067000)

Objective： To investigate the effects of paeonol(Pae) combined with PNS on TNF-α expression in rats with ventricular remodeling after acute myocardial infarction(AMI). Methods： AMI model was made by ligaturing left descending coronary artery. Alive rats with AMI were randomly divided into model group, Pae treated group, PNS treated group, Pae plus PNS treated groups and the positive control group with captopril and the sham operation group. Collagen volume fraction(CVF)by Masson staining and expression of TNF-αwas detected by Western blot assay after four-week，treatments in all groups. Results： Compared with the model group, CVF and the levels of TNF-αreduced to various extents. In Pae plus PNS groups, CVF was lower and the expression of TNF-αwas down-regulated more than in Pae or in PNS group. the effects were more significant in combination of high-dose group than low-dose group. The inhibiting effects were more significant when Pae and PNS were given at higher doses. Conclusions： The combination of Pae and PNS can play an obvious synergistic action in inhibiting ventricular remodeling in AMI rats by down-regulation of TNF-αexpression.

paeonol,PNS, durg combination, ventricular remodeling, TNF-α

2016-09-21

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.C2011406009)，河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZD20131068)

R967

A

1006-5687(2016)06-0009-03

*通訊作者：曹凱，E-mail：caokai58@163.com。