解毒散結(jié)顆?！吨袊幍洹?015年版微生物限度檢查方法學驗證

王洪家

(天津市北辰區(qū)藥品檢驗所，天津 300400)

解毒散結(jié)顆?！吨袊幍洹?015年版微生物限度檢查方法學驗證

王洪家

(天津市北辰區(qū)藥品檢驗所，天津 300400)

目的：建立解毒散結(jié)顆粒的微生物限度檢查方法。方法：對解毒散結(jié)顆粒采用《中國藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”項下方法進行微生物限度檢查方法學驗證。結(jié)果：取1∶10供試液，需氧菌總數(shù)采用薄膜過濾法測定，回收率比值均在0.9～1.0；霉菌和酵母菌總數(shù)采用常規(guī)法測定，回收率比值均為1.0；控制菌測定采用常規(guī)法。結(jié)論：可采用薄膜過濾法測定解毒散結(jié)顆粒需氧菌總數(shù)，常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查。

微生物限度，解毒散結(jié)顆粒，薄膜過濾法，常規(guī)法

藥品微生物限度檢查是控制藥品質(zhì)量的一項重要檢查項目，不同成分對微生物有著不同程度的抑制或殺滅作用。檢查藥品污染微生物情況，可以有效檢驗藥品的質(zhì)量。為了能夠更真實地反應藥品受微生物污染的情況，保證人民群眾用藥安全，必須按照《中國藥典》相關(guān)方法對藥品進行微生物限度檢查方法學驗證?！吨袊幍洹?015年版較2010年版在微生物限度檢查方法學驗證方面有了較大的改動。修訂后的微生物限度檢查方法與《美國藥典》基本一致，也能夠更好地與國際接軌，檢測結(jié)果更具可比性，減少了檢測結(jié)果的不一致性[1]。在染菌方式上由試驗菌最后加入改為配制樣品時即加入試驗菌，充分模擬了樣品受微生物污染的狀態(tài)[2]。本文通過試驗，建立了解毒散結(jié)顆粒微生物限度檢查驗證方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BXM-30R立式滅菌器、島津TW223L電子天平、DHG-9075A鼓風干燥箱、GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱、FW-SPH-80A生化培養(yǎng)箱。

1.2 培養(yǎng)基 麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基均由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，均已通過培養(yǎng)基適用性檢查并在使用有效期內(nèi)，培養(yǎng)基的制備按標示方法制備。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104] (均來源于中國食品藥品檢定研究院)。

1.4 樣品 解毒散結(jié)顆粒(天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，規(guī)格為10 g)。

2 方法與結(jié)果

參照《中國藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度檢查法[3]進行驗證。

2.1 方法

2.1.1 菌液制備 取經(jīng)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物各1 ml，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按十倍稀釋級稀釋至10-5～10-7(每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu)的菌懸液，備用。取經(jīng)沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物1 ml，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按10倍稀釋級稀釋至10-5(每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu)的菌懸液，備用。取經(jīng)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將孢子洗脫，然后，吸出孢子懸液，采用雙層紗布過濾菌絲的方法，收集孢子懸液至另一無菌試管內(nèi)作為菌原液，取此菌原液1 ml，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按十倍稀釋級稀釋至10-4(每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu)的菌懸液，備用。

2.1.2 供試液制備 取樣品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至100 ml，混勻，作為1∶10供試液。量取1∶10供試液10 ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至100 ml，混勻，作為1∶100供試液。

2.1.3 需氧菌總數(shù)測定 取“2.1.2”項下1∶10供試液和1∶100供試液各適量，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌各適量，使每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，靜置5 min，使菌種與供試液充分接觸，混勻，吸取各染菌供試液1 ml注入平皿中，平行制備2皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待凝；另吸取1∶10供試液1 ml薄膜過濾，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml分次沖洗，取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，于30～35 ℃培養(yǎng)至規(guī)定時間，測定試驗組菌落數(shù)，同法測定菌液組和供試液對照組及稀釋劑組菌落數(shù)。

2.1.4 霉菌和酵母菌總數(shù)測定 取“2.1.2”項下1∶10供試液適量，分別加入白色念珠菌、黑曲霉2種試驗菌各適量，使每1 ml含菌數(shù)不大于100 cfu，混勻，靜置5 min，使菌種與供試液充分接觸，混勻，吸取染菌供試液1 ml注入平皿中，平行制備2皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝，于20～25 ℃培養(yǎng)至規(guī)定時間，測定試驗組菌落數(shù)，同法測定菌液組和供試品對照組菌落數(shù)。

2.1.5 大腸埃希菌檢查 取1∶10供試液10 ml置于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入大腸埃希菌適量，使其含菌量不大于100 cfu，混勻，32.5 ℃培養(yǎng)18 h。另取規(guī)定量大腸埃希菌(不大于100 cfu)，加入100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中作為陽性對照組，依相應檢查法進行適用性檢查。

2.2 回收率測定結(jié)果 按公式計算加菌回收率：回收率=[(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%。按《中國藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”項下[1]規(guī)定進行結(jié)果判斷，回收率比值應在0.5～2之間。驗證結(jié)果顯示，1∶10供試液需氧菌總數(shù)測定枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌回收率比值均為0，其他各菌回收率比值均達到試驗要求，1∶100供試液需氧菌總數(shù)枯草芽孢桿菌回收率比值為0.3，葡萄球菌回收率比值達到試驗要求；采用1∶10供試液1 ml薄膜過濾，需氧菌總數(shù)枯草芽孢桿菌回收率比值為0.9，其他各菌回收率比值均達到試驗要求。1∶10供試液霉菌和酵母菌總數(shù)測定，兩種菌回收率均達到試驗要求?？刂凭鷻z查結(jié)果均有菌生長，菌落形態(tài)符合相應菌落特征。結(jié)果見表1-表5。

表1 1∶10供試液需氧菌總數(shù)回收率比值

表2 1∶100供試液需氧菌總數(shù)回收率比值

表3 1∶10供試液需氧菌總數(shù)薄膜過濾回收率比值

表4 霉菌與酵母菌總數(shù)回收率比值

表5 控制菌檢查

2.3 試驗結(jié)果 試驗結(jié)果表明，解毒散結(jié)顆?？梢圆捎帽∧み^濾法測定需氧菌總數(shù)，采用常規(guī)法測定霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查。

3 討論

《中國藥典》2015年版與2010年版相比，增加了供試品制備中的稀釋液種類，采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基取代了營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于需氧菌總數(shù)檢查，采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基取代了玫瑰紅鈉培養(yǎng)基檢測霉菌與酵母菌總數(shù)；將原來的細菌總數(shù)檢查更名為需氧菌總數(shù)檢查，這其中就包括了細菌、霉菌、真菌等可在此培養(yǎng)基上生長的微生物；2010年版《中國藥典》所使用的培養(yǎng)基對目標菌的選擇性強，不能滿足所有微生物的生長需要，而2015年版《中國藥典》所使用的培養(yǎng)基具有良好的廣譜性，對目標微生物生長選擇性低，有利于微生物的修復與生長，提高檢出率[1]。在控制菌檢查上增加了耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，簡化了大腸埃希菌的檢驗方法，變更了乙型副傷寒沙門菌的培養(yǎng)基種類，取消了大腸菌群的檢查。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，該藥品采用2010年版《中國藥典》的驗證方法，采用離心沉淀加培養(yǎng)基稀釋法即可消除其抑菌性，但2015年版《中國藥典》取消了離心沉淀法，只采用培養(yǎng)基稀釋法不能消除其抑菌性，只能采用薄膜過濾法方可滿足試驗要求，說明新的驗證方法能夠更真實的反應藥品受微生物污染程度。

1 李趣嫦，江艷芳. 《中國藥典》2010版與2015版微生物限度檢查法對四種藥物檢測結(jié)果的比較[J].中國藥品標準，2015,16(2)：86-90

2 李偉. 睪酮凝膠微生物限度檢查方法適用性試驗的研究[J].天津藥學，2015,27(4)：24-26

3 中國藥典[S].四部.2015：140-151

2016-05-19

R921.2

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1006-5687(2016)04-0017-03