血漿游離cf-DNA定量分析在膿毒癥患者診斷中的臨床價值

銀雪 楊敬平 孫德俊 王文明

·論著·

血漿游離cf-DNA定量分析在膿毒癥患者診斷中的臨床價值

銀雪1楊敬平2孫德俊1王文明1

目的探討膿毒癥患者血漿游離DNA(cf-DNA)定量檢測的臨床應(yīng)用價值。方法選取2012年11月至2013年5月，收治于包鋼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的35例膿毒癥患者和31例全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)患者，并以17例健康者血漿作為對照樣本；用“血漿游離DNA提取試劑盒”提取血漿cf-DNA，采用熒光定量PCR技術(shù)(SYBR Green I染料法) 檢測血漿DNA水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清降鈣素原(PCT)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平，并應(yīng)用ROC曲線分析比較cf-DNA、PCT及CRP在膿毒癥診斷中的價值。結(jié)果膿毒癥組cf-DNA明顯高于SIRS組和健康對照組，差異有顯著性(P<0.001)；入院第1天cf-DNA濃度顯著高于第3天，差異有顯著性(P<0.001)；入院第1天的cf-DNA濃度與SOFA評分具有相關(guān)性，SOFA評分越高，其cf-DNA越高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.561，P<0.001)；以血漿cf-DNA濃度≥8 939 GE/ml作為診斷膿毒癥的臨界值，其檢測的靈敏度為77.14%，特異度為80.65%。結(jié)論血漿游離DNA的定量檢測可作為膿毒癥的早期預(yù)測、隨訪觀察療效和監(jiān)測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

cf-DNA； 降鈣素原； C-反應(yīng)蛋白； ROC曲線； 膿毒癥

膿毒癥是感染灶或存在細菌引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，是細菌對宿主的一種全身性感染反應(yīng)，患病率高[1]。血漿游離DNA(cell-free DNA，cf-DNA)是一種無細胞狀態(tài)的、片段化的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中，與細胞凋亡具有相關(guān)性[2]。近幾年已經(jīng)報道了某些臨床疾病的血液中含有高濃度的cf-DNA，如癌癥、創(chuàng)傷、燒傷、急性心肌梗死、中風(fēng)、休克等[3]。其中，膿毒癥患者和危重癥患者的血液中cf-DNA的含量明顯上升[4-5]。本實驗通過測定膿毒癥患者血漿標(biāo)記物cf-DNA，并與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、降鈣素原(procalcitonin, PCT)相比較以此判斷其診斷膿毒癥的精準(zhǔn)度。

資料與方法

一、一般資料

收集2012年11月1日至2013年5月30日在我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2001年12月在華盛頓召開的“國際膿毒癥會議”標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中SIRS組31例，男性20例，女性11例，年齡為20～84歲，平均年齡62歲；膿毒癥組35例，男性20例，女性15例，年齡為27～79歲，平均年齡69歲；健康對照組為本單位健康體檢者，共17例，男10例，女7例，年齡為41～70歲，平均年齡63歲。病例組和對照組相比，年齡、性別無顯著性差異。其中，膿毒癥組原發(fā)病灶包括：肺部感染28例，急性扁桃體炎2例，泌尿系感染4例，膽系感染1例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①獲得性免疫缺陷綜合征；②器官移植術(shù)后接受過免疫抑制劑治療；③前4周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素；④前8周內(nèi)接受過化療；⑤年齡<18歲；⑥中途自動出院而退出者。

二、主要試劑和儀器

血漿游離DNA提取試劑盒(北京久峰潤達生物技術(shù)有限公司)、血液基因組柱式小量提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、引物(GAPDH)由上海英濰捷基有限公司合成、全自動酶標(biāo)儀、實時熒光定量PCR儀、低溫高速離心機。

三、實驗步驟

1. DNA的提?。核腥虢M患者均于入院時、入院第3天取外周靜脈血2 ml置于EDTA管中，所有標(biāo)本均2 h內(nèi)處理。處理方法：室溫靜置30 min后，4 ℃ 1 600×g離心10 min取上層血漿(勿觸碰白膜層)1 000 μl，再以4 ℃ 12 000×g離心10 min仔細吸取上清500 μl，置于無菌EP管中。同樣方法收集健康志愿者外周靜脈血。以“血漿游離DNA提取試劑盒”說明書(北京久峰潤達生物技術(shù)有限公司，TX-50)進行抽提，提取cf-DNA。以EDTA管抽取正常健康人外周靜脈血2 ml，以“血液基因組柱式小量提取試劑盒”(北京康為試劑生物技術(shù)有限公司，CW2087)進行抽提，提取全基因組DNA。每個標(biāo)本最后洗脫液為50 μl。

2. 引物設(shè)計：根據(jù)NCBI gene bank上編號NM_002046.3(GAPDH)，按SYBR Green Ⅰ 定量PCR引物設(shè)計要求設(shè)計定量PCR擴增引物。TH-GAPDH-F：5-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3′,TH-GAPDH-R: 5-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′，引物由上海英濰捷基有限公司設(shè)計并合成。

3. 實時熒光定量PCR： PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，包括10 μl SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μl上游引物，0.8 μl 下游引物，8.4 μl待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。每個樣本和空白對照都設(shè)立重復(fù)管。反應(yīng)條件：預(yù)變形95 ℃ 30 s，變形95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s延伸72 ℃ 20 s(共40個循環(huán))。

4. 血清PCT、CRP的檢測：本院檢驗科檢測，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進行分析，三組比較采用方差分析，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本比較采用秩和檢驗，雙變量相關(guān)分析用Spearman相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，評價各指標(biāo)診斷膿毒癥的能力采用ROC曲線。

結(jié) 果

一、患者的基本資料

入選的發(fā)熱患者66例，其中膿毒癥組35例，SIRS組31例，膿毒癥組中院內(nèi)死亡率、APACHE Ⅱ評分、SOFA評分均高于SIRS組，差異有顯著性(P<0.001)，SIRS組的肌酐清除率與膿毒癥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)，二組之間年齡比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)，見表1。

表1 二組患者的基本資料(n)

注：P值為膿毒癥和SIRS兩者比較

二、入院后第1天二組cf-DNA的比較及其PCT、CRP的關(guān)系

17例正常人外周血漿游離DNA濃度為188(166-258)GE/ml，與SIRS組及膿毒癥組之間血漿游離DNA比較，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，經(jīng)兩兩比較，膿毒癥組的cf-DNA的濃度高于正常對照組(P<0.001)及SIRS組(P<0.001)，差異有顯著性；SIRS組cf-DNA的濃度高于正常對照組(P=0.011)，差異有顯著性。由表2得知，膿毒癥組的cf-DNA、PCT及CRP濃度均顯著高于SIRS組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

三、入院第1天與第3天cf-DNA的比較

根據(jù)血漿游離DNA測得的時間不同，第1天cf-DNA的中位數(shù)為9 088 GE/ml，四分位數(shù)間距為5 584～14 791 GE/ml，第3天cf-DNA的中位數(shù)為7 337 GE/ml，四分位數(shù)間距為4 460～12 437 GE/ml，二者存在顯著性差異(P<0.001)，膿毒癥患者經(jīng)過治療后cf-DNA較入院時明顯降低，見圖1。

圖1 不同時間cf-DNA的濃度比較

四、cf-DNA、PCT、CRP在膿毒癥患者中的預(yù)測價值及cf-DNA與SOFA評分的關(guān)系

入院第1天cf-DNA在預(yù)測死亡率的靈敏度為100%，特異度為75.86%。如圖2示，cf-DNA的AUC為0.92，95%可信區(qū)間為0.776～0.984，可以認(rèn)為cf-DNA在膿毒癥患者中預(yù)測死亡率價值高，其cutoff值為21 150 GE/ml；而PCT、CRP的預(yù)測價值低，AUC分別為0.684和0.649，其中陽性似然比、陰性似然比，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值，見表3。

圖2 ROC曲線

入院后患者進行SOFA評分。與入院第1天血漿旅游DNA比較，二者具有相關(guān)性(r=0.561,P<0.001)，見圖3。將SOFA評分結(jié)果分為四組，并命名為group1(0～6)、group2(7～9)、group3(10～11)、group4(12～19)，與入院第1天cf-DNA進行兩兩比較， group1 與group3之間差異有顯著性(P=0.02)，group1 與group4之間差異有顯著性(P=0.001)，group2 與group4之間差異有顯著性(P=0.004)，可以得知，SOFA評分越高，其cf-DNA越高，見圖4。

圖3 cf-DNA與SOFA之間的線性相關(guān)性

表2 二組患者血漿游離DNA、PCT及CRP的比較

注：與SIRS比較，aP<0.01，Md：中位數(shù)；IQR：四分位數(shù)間距

表3 膿毒癥患者cf-DNA、PCT及CRP對死亡率的評估

注：Cutoff：診斷點，AUC:受試者工作特征曲線下面積，Sens:靈敏度，Spec：特異度，PPV：陽性預(yù)測值，NPV：陰性預(yù)測值，+LR：陽性似然比，-LR: 陰性似然比

圖4 cf-DNA與SOFA評分的關(guān)系

討 論

膿毒癥是病原菌感染的全身炎癥反應(yīng)綜合征，若診治不及時，可快速發(fā)展為膿毒癥休克和多臟器功能障礙綜合征，其病情危險，病死率高。近年來發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者可能與細胞凋亡有關(guān)，其中cf-DNA在各種慢性和急性疾病中廣泛的受到關(guān)注和研究[7]。cf-DNA是一種片段化、小的雙鏈分子、無細胞狀態(tài)的的胞外DNA，具有較低的分子量[8]，廣泛存在于腦脊液、血液及滑膜中，其在正常人的血液中含量甚微，而機體在特殊狀態(tài)時，如感染、腫瘤、中風(fēng)、心?；蛉焉锏萚9]，含量顯著增加。另外，創(chuàng)傷和治療過程中，也可能導(dǎo)致游離DNA釋放到循環(huán)血液中[10]，其檢測早已應(yīng)用于臨床[11-12]。高濃度cf- DNA與重癥患者入住ICU具有良好的相關(guān)性[13-14]。這表明cf-DNA學(xué)標(biāo)記物可作為預(yù)測膿毒癥指標(biāo)之一。目前許多實驗都表明細胞凋亡定量的建立對膿毒癥診斷至關(guān)重要[15]。本研究結(jié)果表明，cf-DNA濃度與疾病的嚴(yán)重程度成比例增加(膿毒癥組的cf-DNA濃度顯著高于SIRS組)，并且第1天的血漿游離DNA的結(jié)果可以作為預(yù)測死亡率的指標(biāo)，這與早前的研究存在一致性[16]。

目前，PCT和CRP是診斷細菌和真菌感染最有價值的生物標(biāo)志物[17]。PCT是一種無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，在體外穩(wěn)定性很好，血漿PCT在健康人血液中含量極低。有研究發(fā)現(xiàn)，機體被細菌、寄生蟲和真菌感染時，PCT水平顯著增加與感染的嚴(yán)重程度及預(yù)后呈相關(guān)性。其在全身性細菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后判斷等方面的臨床價值頗高[18]。CRP是一個重要的急性反應(yīng)蛋白，參與不同病理過程的免疫反應(yīng)，在各種急性炎癥、心肌梗塞、放射性損傷、手術(shù)創(chuàng)傷等疾病發(fā)作后數(shù)小時可成倍增長，病變好轉(zhuǎn)可降至正常，但其特異性差。研究發(fā)現(xiàn)cf-DNA對感染診斷價值比PCT、CRP診斷價值高[19]，而本研究結(jié)果也與文獻報道相一致。

SOFA評分是一類描述MODS的發(fā)生、發(fā)展和評估發(fā)病率的評分系統(tǒng)，可預(yù)測預(yù)后，并對疾病的發(fā)病率、疾病過程、病情判斷可有更加深入的認(rèn)識，同時也可評價新的治療方案對器官功能或衰竭過程的影響，還可評估預(yù)后、預(yù)測死亡率[20-29]。本實驗利用SOFA評分可預(yù)測死亡率這一優(yōu)點，結(jié)合cf-DNA，觀察SOFA評分與cf-DNA之間的關(guān)系。研究顯示，入院時SOFA評分越高，病情越重，死亡風(fēng)險越高，其cf-DNA濃度越高，這與Saukkonen等[4]研究結(jié)果相一致。ROC曲線是靈敏性和特異性的相互關(guān)系評定指標(biāo)。曲線下的面積越大，診斷價值越高，本實驗結(jié)果顯示，cf-DNA在膿毒癥患者中預(yù)測死亡率價值最高，而PCT、CRP的預(yù)測價值最低。因此cf-DNA可作為預(yù)測膿毒癥指標(biāo)之一。

cf-DNA可以作為預(yù)測膿毒癥的輔助指標(biāo)，其不足之處是不能完全診斷膿毒癥，PCT、CRP 及cf-DNA聯(lián)合檢測可能是今后這一領(lǐng)域的主要研究方向，但有些方面仍存在較大分歧，仍然需要大樣本、多中心和前瞻性的隨機研究。隨著對膿毒癥相關(guān)特異性的不斷深入研究，cf-DNA檢測將會具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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(本文編輯：王亞南)

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Quantitative analysis of cell-free plasma DNA in human sepsis

YinXue1,YangJingping2,SunDejun1,WangWenming1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,theWuhaiPeople′sHospital,Wuhai016000,China;2RespiratoryandCriticalCareMedicine,BaoganHospital,Baotou014010,China

YangJingping,Email：yangron@sina.com.cn

Objective To quantify the circulating DNA in plasma from patients with sepsis,evaluate its potential clinical significance. Methods Plasma DNA from 83 cases(35 cases with sepsis is the sepsis group, 31 cases with systemic inflammatory response syndrome is the SIRS group, and 17 cases is the healthy control group) extracted using a Plasma free DNA extraction kit and was quantified by a real-time PCR method(SYBR Green I dye assay), concentrations of procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay, receiver operating characteristic(ROC) curves were plotted to analysis diagnosis value in the sepsis which through quantity of cf-DNA , PCT and CRP. Results The cf- DNA in sepsis was significantly higher (P<0.001) than that of the patients with SIRS and the healthy controls; The concentration of cf-DNA in the first day was significantly higher (P<0.001) than the patients of the third day; the plasma free DNA concentration of the first day associated with SOFA score(r=0.561,P<0.001), the higher cf-DNA are, the higher SOFA score; The best cutoff value of plasma DNA at baseline was 8 939 GE/ml, with a sensitivity of 77.14%, specificity of 80.65%. Conclusion cf-DNA quantification may be a useful marker for early prediction of sepsis, and for monitoring the therapeutic efficacy and recurrence.

cf-DNA; Procalcitonin; C-reactive protein; Receiver operating characteristic; Sepsis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.011

社會發(fā)展科技支撐項目(2013S2006-1-4)

016000 內(nèi)蒙古 烏海，烏海市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科1014010 包頭，包鋼醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

楊敬平，Email：yangron@sina.com.cn

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A

2015-11-23)