重視循環(huán)腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應(yīng)用

曾瑄 梁智勇

·專家論壇·

重視循環(huán)腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應(yīng)用

Pay attention to clinical application of circulating tumor cells test in non small cell lung cancer

曾瑄 梁智勇

梁智勇，主任醫(yī)師，教授，博士生導師,北京協(xié)和醫(yī)院病理科主任?，F(xiàn)任中華醫(yī)學會病理學分會侯任主任委員，中國醫(yī)師學會病理科醫(yī)師分會副會長，中國醫(yī)療保健國際交流促進會理事/病理專業(yè)委員會常務(wù)副主任委員，中國研究型醫(yī)院學會病理專業(yè)委員會副主任委員，中華醫(yī)學會病理學分會、中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會及國家衛(wèi)生計生委病理質(zhì)控中心分子病理組組長，北京醫(yī)學會病理學分會副主任委員，《診斷病理學雜志》總編，《中華病理學雜志》、《臨床與實驗病理學雜志》、《Endocrine Pathology》、《Chronic Diseases》and《Translational Medicine》編委。

非小細胞肺癌； 循環(huán)腫瘤細胞； 分子檢測

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)是在惡性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)的一種源于腫瘤的上皮細胞。一般來說，CTCs極其罕見，與白細胞的比率大約為1︰106-107。所以CTCs富集技術(shù)的突破是該研究得以深入進行的必要前提。美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)曾先后批準了基于上皮標記(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)的CTCs獲取并計數(shù)的技術(shù)平臺(cellsearch)用于乳腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌的預后評估。2015年中國食品和藥物管理局(China Food and Drug Administration, CFDA)批準了上皮源性的CTC檢測試劑盒用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的監(jiān)測。

近來，相關(guān)研究顯示CTCs也可在非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)的診斷、生物學特性的確認和疾病監(jiān)測中發(fā)揮重要的作用，而隨著技術(shù)的發(fā)展，CTCs分子特征的檢測更突顯出其獨特的臨床價值。比如，在某些特定的情況下，由于組織或細胞病理學材料無法獲取，并且在疾病進程中難以實現(xiàn)多次活檢，為及時了解腫瘤生物學特征的變化而適時采取有效治療措施，CTCs檢測可提供很好的幫助。

CTCs的富集主要包括基于物理的和生物的兩類方法，前者包括膜過濾(如ISET)、芯片過濾(如Cluster Chip)、密度梯度離心(如Ficoll.Paque)、聲動力(如Acoustophoresis Chip)及電泳(如DEPArray)等；后者主要包括正向(選擇CTCs，如cellsearch)和負向(選擇白細胞, 如CTC.iChip)免疫富集法等[1]。

起初，CTCs的檢測方法，主要是針對核酸和蛋白特征，例如通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcript polymearse chain reaction, RT-PCR)檢測腫瘤細胞mRNA的差異表達來推斷CTCs的存在；而定量PCR的使用, 與普通PCR相比, 又進一步提高了靈敏度和特異性。但此類技術(shù)因缺乏形態(tài)學及數(shù)目等重要信息，而被新技術(shù)取代，以計數(shù)為主要目標的CTC技術(shù)則成為主流。隨后，在此基礎(chǔ)上不斷迭代更新，衍生出諸多更優(yōu)化的平臺。目前應(yīng)用最多的是基于上皮細胞標記(生物法)和上皮細胞大小(物理法)而分離肺癌CTCs 的方法，例如cellsearch和ISET等。前者結(jié)合了免疫磁珠標記和自動數(shù)字顯微鏡技術(shù)，先以納米磁珠包被的抗EpCAM的抗體富集上皮細胞，然后分別以熒光標記的抗CK和CD45的抗體檢測富集的標本，再行自動顯微成像計數(shù)分析；后者是一種基于細胞大小的微膜過濾技術(shù)，因為大多數(shù)腫瘤細胞直徑大于(>8 μm)白細胞, 富集的細胞可以于微膜上進行染色及進一步分析。它既可獲取單個CTCs，也可獲取循環(huán)腫瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)，而且規(guī)避了cellcearch技術(shù)的假陽性(EpCAM表達的非腫瘤細胞)和假陰性(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時EpCAM高表達缺失)；但該方法仍有小的CTCs可能被漏檢，而大的白細胞可能被截留等不足。

鑒于上述工作的積累，涌現(xiàn)出了更多的CTCs技術(shù)平臺，例如除了考慮混合間質(zhì)標記(如OncoCEE)外，還結(jié)合相關(guān)生物標記(如liquid biopsy)以及物理方法(如GEDI)等。這些方法在提高CTCs的富集效率和完善體系等方面，做了有意義且較成功地探索。

近來，一種體內(nèi)捕獲CTCs的技術(shù)(GILUPI CellCollector，DiagnostikNet, German)在肺癌研究中得以有效地嘗試，它是通過肘靜脈留針(30 min)的方式獲取與附著抗體結(jié)合的上皮細胞。因不受采血量的限制，規(guī)避了肺癌可能因上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchimal transition, EMT)高發(fā)所帶來的上皮標記陽性細胞減少而難于獲取目標CTCs的問題；但若要對獲取器上的CTCs進行形態(tài)學染色分析，則將是面臨的一個新的挑戰(zhàn)。CTC的技術(shù)發(fā)展很快，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)并彌補了原有方法的各種不足，但最終目的是力求在改進和創(chuàng)新中逐步完善。當下，各種平臺互補是大多數(shù)學者最多采用的策略[2]。

近年來, 隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展, 以及患者全程精細化管理的需求, 國內(nèi)液體活檢技術(shù)也有了突破性進展, 以血液游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)為代表的液體活檢(liquid biopsy)技術(shù), 已陸續(xù)獲批CFDA而用于臨床常規(guī), 成為組織或細胞標本不足以滿足分子標記，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變，檢測需求時的補充材料，并先后于2015年和2016寫入肺癌的相關(guān)診療指南中[3-4]。隨后，中國學者采用納米基質(zhì)包被抗體的技術(shù)(Nano Velcro)，顯著提高了肺癌CTCs的捕獲效率[5]。與以往相比，在液體活檢的探索中，國內(nèi)的發(fā)展呈現(xiàn)出更快更強的勢頭。

目前，絕大多數(shù)常規(guī)分子標記檢測技術(shù)均可以在CTCs上有效地實施，如PCR, FISH及IHC等，這一點十分重要。肺癌的分子分型是制定有效的個體化治療方案的重要參考依據(jù)。譬如EGFR基因敏感突變(如19外顯子缺失或21外顯子L858R)的患者，是EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)，如(易瑞沙(gefitinib)、凱美納(conmana)、特羅凱(tarceve)及阿法替尼(afatinib)等獲益的候選人群；淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)或ROS1基因重排的患者，治療則首選ALK抑制劑，如克唑替尼(crizotinib)；而PD-L1表達陽性的患者對免疫檢查點抑制劑(如派姆單抗Keytruda)顯示出具有很好的療效[6]。CTCs分子特征的檢測，尤其針對治療過程中(實時組織活檢很難實現(xiàn))及時發(fā)現(xiàn)耐藥并適時調(diào)整后續(xù)治療方案(T790M 將受益于靶向藥AZD9291)，具有重要的意義。

Maheswaran等[7]以ARMS法同時檢測了27例NSCLC的CTCs和cfDNA標本，并以原發(fā)灶組織活檢作為對照，檢出EGFR基因突變率分別為92%和33%。Ran等[8]以負向富集法獲取了37例NSCLC患者的CTCs后，采用激光顯微切割分離出單個CTCs并進行全基因組擴增，繼而以PCR測序檢出EGFR基因19外顯子缺失、L858R和T790M分別為85%、55%和45%。Marchetti等[9]以cellSearch獲取CTCs后，以NGS檢出EGFR基因突變率為84%，與組織學結(jié)果一致。Pailler等[10]采用上皮和間質(zhì)雙標記富集CTCs后，以FISH法檢測了ALK重排，全部18例組織標本ALK陽性的患者中，均檢出數(shù)量不等的CTCs，并且具有ALK重排特征，其中包括上皮標記陰性的CTCs(EMT)，而且CTCs之間存在異質(zhì)性(分別具有3’/5’分離或僅有3’信號的特征)；Pailler等[11]針對4例組織學ROS1陽性的NSCLC患者，以ISET法均檢出了CTCs，且以FISH法確認均為ROS1陽性，與組織學結(jié)果一致，而且發(fā)現(xiàn)CTCs之間存在遺傳異質(zhì)性(ROS1基因拷貝數(shù)不同)。

與已知的其它幾種較易發(fā)現(xiàn)CTCs的腫瘤相比，肺癌可能有更高的EMT機率，憑借傳統(tǒng)的基于上皮標記的富集技術(shù)往往難以得到可靠穩(wěn)定的CTCs數(shù)據(jù)，而且也不能準確反映腫瘤的變化特征；而若采用一組上皮與間質(zhì)混合抗體進行CTCs捕獲，雖然一定程度上克服了上述不足，但仍存在尚待一些解決的問題。Schehr JL等，采用含有上皮和間質(zhì)標記(EpCAM, MUC1或Vimentin)的組合抗體富集NSCLC的CTCs，發(fā)現(xiàn)幾種常用抗體對CTCs均有不同程度的誤識別(例如 CD11b+骨髓細胞)，而CD45表達缺失的中性粒細胞和不成熟的骨髓細胞也會有一定程度的PD-L表達，這將影響PD-L1表達陽性CTCs的準確檢出[12]。

與僅辨別有否CTCs或其數(shù)量的變化相比，CTCs的分子特征檢測具有更重要的臨床意義，它除了可以揭示腫瘤進展過程中分子變化規(guī)律，為尋求針對性地治療措施提供理論依據(jù)外，也是深入了解耐藥的分子基礎(chǔ)及腫瘤異質(zhì)性特征的最佳材料，可為研發(fā)特異性的靶向藥或相關(guān)治療手段提供重要信息。另外，尚存在大多數(shù)CTCs檢測技術(shù)操作環(huán)節(jié)多，分析過程復雜，易受人為因素影響等有待改進之處。期待隨著研發(fā)技術(shù)的更新與突破、研究數(shù)據(jù)的大量積累，具有高效富集、自動化程度高、性能穩(wěn)定、識別準確、可操作性強的CTCs系統(tǒng)，在不遠的未來應(yīng)用于臨床。

1 Ferreira MM, Ramani VC, Jeffrey SS. Circulating tumor cell technologies [J]. Mol Oncol, 2016, 10(3): 374-394.

2 Hofman V, Ilie MI, Long E, et al. Detection of circulating tumor cell as a prognostic factor in patients undergoing radical surgery for non small cell lung carcinoma: comparison of the efficacy of the CellSearch AssayTM and the isolation by size of epithelial tumor cell method[J]. Int J Cancer, 2011, 129(7): 1651-1660.

3 《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制訂專家組. 非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2015, 95(46): 3721-3726.

4 中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識(2016版)[J]. 中華病理學雜志, 2016, 45(4): 217-220.

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6 Herbst RS, Baas P, Kim DW, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial[J]. Lancet, 2016, 387(10027): 1540-1550.

7 Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et al. Detection of mutation in EGFR in circulating lung-cancer cells[J]. N Engl J Med, 2008, 359(4): 366-377.

8 Ran R, Li L, Wang M, et al. Determination of EGFR mutations in single cells microdissected from enriched lung tumor cells in peripheral blood[J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405(23): 7377-7382.

9 Marchetti A, Del Grammastro M, Felicioni L, et al. Assessment of EGFR mutations in circulating tumor cell preparations from NSCLC patients by next generation sequencing: toward a real-time liquid biopsy for treatment[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e103883.

10 Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(18): 2273-2281.

11 Pailler E, Auger N, Lindsay CR, et al. High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J]. Ann Oncol, 2015, 26(7): 1408-1415.

12 Schehr JL, Schultz ZD, Warrick JW, et al. High specificity in circulating tumor cell identification is required for accurate evaluation of programmed death-ligand 1[J]. PLoS One, 2016, 11(7): e0159397.

(本文編輯：張大春)

曾瑄，梁智勇. 重視循環(huán)腫瘤細胞分子檢測在非小細胞肺癌的臨床應(yīng)用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(6)： 587-589.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.001

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2016-11-23)