miR-320在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

程學遠，黃忠

（廣西北海市人民醫(yī)院 普通外科，廣西 北海 536000）

miR-320在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

程學遠，黃忠

（廣西北海市人民醫(yī)院 普通外科，廣西 北海 536000）

目的探討miR-320在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RTPCR）檢測108例乳腺癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中miR-320表達，分析miR-320表達與乳腺癌病理特征的相關(guān)性。結(jié)果乳腺癌組織中miR-320表達水平低于正常乳腺組織[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。乳腺癌組織miR-320表達水平與乳腺癌TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；而miR-320表達水平與年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達、增殖細胞核抗原（PCNA）表達、孕激素受體（PR）表達及雌激素受體（ER）表達無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論miR-320在乳腺癌組織中呈低表達，且其表達水平與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-320可能是乳腺癌特異性診斷潛在標志物和治療新靶點。

miR-320；乳腺癌；臨床病理特征

Abstract:ObjectiveTo evaluate the expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer.MethodsThe expression of miR-320 in 108 cases of breast cancer tissues and normal breast tissue were detected by RT-PCR,and analyzed the correlation between expression of miR-320 in breastcancer,pathological feature and clinical prognosis.ResultsThe miR-320 expression levels of breast cancer tissue were significantly lower than normal breast tissue[(0.58±0.17)vs(1.05±0.21)](P<0.05).The miR-320 expression level was closely correlated with TNM staging and lymph node metastasis(P<0.05),but the miR-320 expression level was no correlated with age,menopause,pathological type,tumor size,C-erbB-2 expression,PCNA expression,PR expression and ER expression (P>0.05).ConclusionsmiR-320 is lowly expression in the breast cancer,and its expression level is closely related with occurrence and development of breast cancer.

Keywords:miR-320;breast cancer;clinicopathological features

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，全世界每年約有130萬乳腺癌新增病例，約有50多萬患者死于乳腺癌[1]。盡管手術(shù)聯(lián)合同步放化療治療早期乳腺癌的長期治愈率可達≥90%，但對于局部晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌仍缺乏令人滿意的治療手段[2]。缺乏具有早期診斷及預(yù)后判定意義的特異性指標是導致乳腺癌臨床診療效果欠佳的重要因素。因此，探尋乳腺癌的發(fā)病機制，明確其早期診斷及治療靶點，對于乳腺癌的臨床診療具有十分重要的意義。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼小分子核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其可通過與靶基因信使核糖核酸3’（messenger ribonucleicacid 3’，mRNA 3’）端非翻譯區(qū)相結(jié)合調(diào)控靶基因mRNA翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，并以此參與細胞增殖、分化及凋亡等過程[3]。miRNAs異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，miRNAs被認為是腫瘤特異性診斷標志物和治療新靶點。miR-320是一種公認的抑癌miRNA，既往研究顯示，miR-320在宮頸癌[4]和結(jié)直腸癌等[5]多種惡性腫瘤組織中低表達。但miR-320在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義尚未明確。本研究旨在探討miR-320表達水平乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以期為乳腺癌的臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 選取2014年7月-2016年9月北海市人民醫(yī)院收治的108例乳腺癌患者。患者均為女性；年齡 27～69 歲，平均（52.35±9.44）歲；所有乳腺癌組織樣本均經(jīng)病理證實為原發(fā)性乳腺癌；術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療，且有完整臨床病理資料。同時取對應(yīng)癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）為對照組，所有癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實為正常乳腺組織。

1.1.2 試劑與設(shè)備 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（購于美國ABI公司），Trizol試劑（購于美國Invitrogen公司），miR-320、U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 取2 mm3樣本組織超聲勻漿，隨后加入1ml Trizol試劑，吹打均勻后室溫靜置10 min 后加入 340 μl氯仿，震蕩均勻，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上層水相并加入等體積的異丙醇，震蕩均勻，室溫反應(yīng)10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫放置15 min以徹底晾干，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶解，取1 μl RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，采用Bio-Rad檢測RNA純度及濃度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取組織總RNA置于1支潔凈PCR 反應(yīng)管中，1 μl Oligo（dT），RNase Free dH2O將溶液總體積補足至6 μl，混勻，70℃水浴10 min，冰浴3 min，向上述聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)管中依次加入下列試劑，總反應(yīng)體系為20 μl∶1 μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μl、10×RT buffer 1.5 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、50 u/μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase（美國Applied Biosystems公司）1.0μl、20 u/μl RNA 酶抑制劑 0.19 μl、總 RNA 1 μl，加 DEPC 水補至 20 μl。反應(yīng)條件：16℃反應(yīng) 30 min，42℃反應(yīng) 30 min，85℃反應(yīng)5 s，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。miR-320逆轉(zhuǎn)錄引物序列，正向引物：5'-TATTCGCACTGGAT ACGACTCCAGC-3’；反向引物：5'-GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGG-3’。U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列，正向引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，反向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。

1.2.3 PCR擴增 取一支潔凈PCR反應(yīng)管，反應(yīng)體系為20μl，冰上依次加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）1 μl、引物 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix（美國 Applied Biosystems公司）10 μl，加雙蒸水補至20μl。反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)10 min，92℃反應(yīng)15s，60℃反應(yīng)1min，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，△Ct值=miR-320Ct值-U6Ct值。miR-320引物序列，正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTG AGA-3'；反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。U6引物序列，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，計數(shù)資料用百分數(shù)（%）表示，組間比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與正常乳腺組織miR-320表達水平比較

乳腺癌組織中miR-320表達水平低于正常乳腺組織[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。

2.2 乳腺癌組織miR-320表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

miR-320表達水平與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），miR-320表達水平年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達及雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達無關(guān)（P>0.05）。見附表。

附表 乳腺癌組織臨床病理特征與miR-320表達水平的相關(guān)性 （±s）

病理特征 例數(shù)miR-320相對表達量t值P值絕經(jīng)是48 0.60±0.24 0.197 0.843否60 0.56±0.15年齡≥40歲 66 0.59±0.28 0.049 0.978<40歲 42 0.57±0.14病理類型浸潤型導管癌 57 0.55±0.20 0.113 0.924浸潤型小葉癌 51 0.60±0.16 TNM分期I、Ⅱ 72 0.68±0.25 3.199 0.035Ⅲ36 0.52±0.13腫瘤大小<2.5 cm 55 0.59±0.20 0.062 0.963≥2.5 cm 53 0.57±0.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是40 0.51±0.15 3.128 0.038否68 0.66±0.23 C-erbB-2表達+38 0.56±0.25 0.127 0.919-70 0.59±0.16 PCNA表達+76 0.57±0.21 0.058 0.964-32 0.59±0.19 PR表達+71 0.57±0.20 0.225 0.821-37 0.60±0.24 ER表達+73 0.59±0.16 0.186 0.859-35 0.57±0.22

3 討論

miRNA屬于高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，并廣泛存在于真核生物中。正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)miRNA表達遵守嚴格的組織、時序特異性；但在腫瘤環(huán)境下，miRNA往往出現(xiàn)異常表達，并起到類似癌基因或抑癌基因的作用[6]。大量研究證實，乳腺癌中存在多種miRNA的異常表達，提示miRNA參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[7-9]。因此，深入研究miRNA與乳腺癌的相關(guān)性，對乳腺癌的臨床診療具有積極的促進作用。

miR-320定位于人類第8號染色體，是新發(fā)現(xiàn)的一類miRNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-320失衡表達可促進惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。WU等[10]研究顯示，口腔鱗狀細胞癌組織中miR-320表達低于正常組織（P<0.05），且miR-320表達水平與腫瘤血管密度呈負相關(guān)（P<0.05），而慢病毒載體轉(zhuǎn)染miR-320可抑制腔鱗狀細胞癌新生血管生成。WAN等[11]研究表明，結(jié)直腸癌組織中miR-320表達低于正常組織（P<0.05），過表達miR-320可抑制結(jié)直腸癌細胞HT-29增殖及侵襲，并降低后者對5-Fu和奧沙利鉑的敏感性，其機制與miR-320靶向調(diào)控叉頭框蛋白 M1（fork head box M1，F(xiàn)OXM1）蛋白表達有關(guān)。宋成等[12]通過對比宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織miR-320表達發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-320表達低于正常宮頸上皮組織（P<0.05），且miR-320表達水平與宮頸癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。上述研究提示，miR-320在多種惡性腫瘤進展過程中發(fā)揮著類似抑癌基因作用，但miR-320在乳腺癌中的作用尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-320表達水平低于正常乳腺組織（P<0.05），該結(jié)果與其他腫瘤的表達情況相似[12-13]，提示miR-320低表達可能在某種程度上促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步分析，乳腺癌組織中miR-320表達與乳腺癌臨床病理特性相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TNM分期越高則miR-320表達越低（P<0.05），提示miR-320可能作為抑癌基因參與乳腺癌的進展過程；遠處淋巴轉(zhuǎn)移者miR-320表達低于無淋巴轉(zhuǎn)移者（P<0.05），提示miR-320低表達可能促進乳腺癌侵襲及遷移[14]。而miR-320表達與年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達、PCNA表達、PR表達及ER表達（P>0.05），提示miR-320表達不易受個體因素或其他因素影響，其可能是乳腺癌早期診斷、療效判定和預(yù)后評估的潛在指標。但值得注意的是，由于miR-320在多種惡性腫瘤組織中具有高表達，故其診斷乳腺癌的特異性較差。因此，聯(lián)合其他血清學指標檢測可能對于提高miR-320針對乳腺癌的特異性有所幫助。

綜上所述，miR-320在乳腺癌組織中呈低表達，且其表達水平與乳腺癌TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-320可能是乳腺癌特異性診斷潛在標志物和治療新靶點。

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Expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer

Xue-yuan Cheng,Zhong Huang
(Department of General Surgery,the People's Hospital of Beihai City,Beihai,Guangxi 536000,China)

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.012

1005-8982（2017）15-0058-04

2016-11-17

北海市本級科學研究與技術(shù)開發(fā)項目研發(fā)類資助（No：201602028）