分子遺傳標(biāo)記技術(shù)及其在動物育種中的研究進(jìn)展

宋志芳，于國生，，解佑志，蘆春蓮，2，曹洪戰(zhàn)，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)豬業(yè)科學(xué)研究所，河北 保定 071000）

分子遺傳標(biāo)記技術(shù)及其在動物育種中的研究進(jìn)展

宋志芳1，于國生1，，解佑志1，蘆春蓮1，2，曹洪戰(zhàn)1，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)豬業(yè)科學(xué)研究所，河北 保定 071000）

遺傳標(biāo)記經(jīng)歷了從傳統(tǒng)的標(biāo)記即形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記到現(xiàn)代分子標(biāo)記的發(fā)展，分子標(biāo)記具有很多優(yōu)勢，也促進(jìn)了動植物育種、人類醫(yī)學(xué)、基因定位以及構(gòu)建遺傳圖譜的改革。遺傳標(biāo)記能應(yīng)用于畜禽的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系的研究、遺傳圖譜的構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇和QTL定位等領(lǐng)域，文章主要綜述了分子標(biāo)記在標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。

標(biāo)記輔助選擇；分子育種；分子標(biāo)記

1 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記作為一種遺傳標(biāo)記，以個體間核苷酸序列的變異為基礎(chǔ)，能夠直接反映出DNA水平的遺傳多態(tài)性，有廣義分子標(biāo)記和狹義分子標(biāo)記之分。廣義的分子標(biāo)記一般指DNA序列或蛋白質(zhì)，能夠遺傳且可檢測；狹義的分子標(biāo)記一般指特異性DNA片段，能夠反映生物個體或種群間基因組中的差異。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下幾個要求：具有高多態(tài)性；共顯性遺傳（即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中的基因型）；能明確辨別等位基因；遍布整個基因組；要求分子標(biāo)記在整個基因組中分布均勻；即無基因多效性；檢測手段簡單、快速；成本低；重復(fù)性好。但是在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，分子標(biāo)記很難達(dá)到理想狀態(tài)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)出現(xiàn)了種類不同的分子標(biāo)記，比如限制性片段長度多態(tài)性、小衛(wèi)星序列、微衛(wèi)星序列或簡單重復(fù)序列、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性、特定序列位點(diǎn)、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性以及脈沖場電泳等。在實(shí)際應(yīng)用中，能根據(jù)研究目的而定向選擇。分子標(biāo)記在多領(lǐng)域都有應(yīng)用，其中在標(biāo)記輔助選擇（MAS）上的應(yīng)用推動了育種工作的發(fā)展。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在MAS的應(yīng)用

2.1 標(biāo)記輔助選擇的概念

利用與數(shù)量性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，以標(biāo)記信息為輔助信息，可以從分子水平準(zhǔn)確快速地分析個體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對基因型的選擇。此外，能夠充分利用遺傳標(biāo)記、系譜和表型信息，與常規(guī)育種方法相比，信息量更豐富、選擇準(zhǔn)確性更高。利用MAS法能夠?qū)ふ曳肿舆z傳標(biāo)記和進(jìn)行MAS育種。在動物育種中，利用標(biāo)記基因型能非常準(zhǔn)確地估計(jì)數(shù)量性狀的育種值。MAS可以先對遺傳標(biāo)記進(jìn)行選擇，然后對控制某性狀的QTL進(jìn)行間接選擇，最終達(dá)到對該性狀進(jìn)行選擇的目標(biāo)；或者通過遺傳標(biāo)記來預(yù)測個體基因型值或育種值。

2.2 尋找分子遺傳標(biāo)記的主要方法

2.2.1 候選基因法

候選基因法分析的基本原理是先假設(shè)所選標(biāo)記或基因本身就是影響性狀的主基因，根據(jù)已知的生理、生化背景知識，直接從已知或潛在的基因系統(tǒng)中找到可能作用于該性狀的候選基因，也可以參考比較醫(yī)學(xué)、比較基因組學(xué)等的研究結(jié)果，將其他物種（如人類、小鼠等）中發(fā)現(xiàn)的控制某些同類或相似性狀的基因作為動物經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因，然后檢測該基因是否是控制動物性狀的候選基因。采用候選基因法尋找分子遺傳標(biāo)記時必須遵循設(shè)計(jì)候選基因的引物，擴(kuò)增基因的特定片段，尋找多態(tài)位點(diǎn)等特定的研究步驟。我國經(jīng)常使用候選基因法進(jìn)行研究，因?yàn)樵摲椒ㄟx擇多態(tài)位點(diǎn)較簡單易行、方法步驟操作不繁瑣、統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效率高、成本少、結(jié)果便于應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，成為基因組分析的首選方法。

2.2.2 基因組掃描法

基因組掃描是先在全基因組范圍內(nèi)尋找遺傳標(biāo)記，且該遺傳標(biāo)記與目標(biāo)性狀或基因緊密連鎖，然后根據(jù)尋找的標(biāo)記在染色體上定位相關(guān)基因。通常先進(jìn)行全基因組掃描將性狀相關(guān)位點(diǎn)定位于染色體的某個區(qū)域，然后再進(jìn)行候選基因策略或連鎖不平衡分析，確定有關(guān)基因位點(diǎn)。得到定位結(jié)果需要進(jìn)行遺傳分析，一般來說定位的區(qū)域比微衛(wèi)星定位要小很多。

3 影響標(biāo)記輔助選擇效果的因素

與常規(guī)育種方法相比，標(biāo)記輔助選擇的選擇效果較好，但是研究結(jié)果不一致，可能與影響標(biāo)記輔助選擇效率的因素有關(guān)，總結(jié)如下：

3.1 遺傳標(biāo)記與數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）的連鎖關(guān)系

遺傳標(biāo)記與QTL或目的基因連鎖的越緊密，MAS的選擇效率就越高[1-3]。如果標(biāo)記與QTL連鎖不緊密，也就是兩者之間距離變大時，發(fā)生重組的可能性增大，造成的結(jié)果是降低了選擇效率。Smith等[4]指出重組是將標(biāo)記與QTL連鎖關(guān)系用于選擇的最大障礙，重組會導(dǎo)致連鎖不平衡的降低，從而降低標(biāo)記輔助選擇的作用，標(biāo)記輔助選擇所取得的遺傳進(jìn)展會隨著發(fā)生重組概率的增加而降低。

3.2 QTL的數(shù)目和效應(yīng)

某一數(shù)量性狀由多個基因共同作用，目前已經(jīng)檢測出了大量與數(shù)量性狀相關(guān)的QTL，比如已經(jīng)檢測出了1萬多與豬性狀關(guān)聯(lián)的QTL，包括生長性狀、繁殖性狀、胴體性狀、疾病等，關(guān)于這些性狀的QTL數(shù)量不一。如果控制某一數(shù)量性狀的QTL數(shù)量較多時且效應(yīng)較大時，應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行育種能取得很好的效果。但是如果QTL的效應(yīng)比較小時，標(biāo)記輔助選擇就沒有應(yīng)用價(jià)值，達(dá)不到預(yù)期的目標(biāo)。也有研究表明QTL的數(shù)量太多時，QTL之間的連鎖程度增加，同時增加了計(jì)算的復(fù)雜性，會影響MAS的選擇效率。也有研究表明隨著QTL遺傳方差的增大，取得的遺傳進(jìn)展越高[5]。

3.3 估計(jì)QTL效應(yīng)的準(zhǔn)確性

提高QTL估計(jì)的準(zhǔn)確性是影響MAS選擇效果的一個關(guān)鍵因素，估計(jì)值過高或過低都會影響選擇結(jié)果。如果估計(jì)QTL效應(yīng)值的結(jié)果不準(zhǔn)確或錯誤，也會影響遺傳進(jìn)展的改良[6]。所以在估計(jì)QTL的育種值時，一定要采取合理、科學(xué)的方法進(jìn)行估計(jì)，避免錯上加錯。

3.4 相關(guān)性狀的遺傳特性

與高遺傳力性狀和早期表達(dá)的性狀相比，采用MAS法對低遺傳力性狀、限性性狀和抗病性狀進(jìn)行選擇得到的效果要好，但是這并不能說明性狀的遺傳力越低，選擇的效率越高。因?yàn)槿绻z傳力很低時，會影響標(biāo)記被檢測出的幾率和標(biāo)記與QTL的連鎖效應(yīng)，最后降低了MAS的選擇反應(yīng)。中等遺傳力的性狀可以使用MAS法進(jìn)行選擇[7-9]。

3.5 群體規(guī)模

群體規(guī)模也是影響MAS效率的一個重要原因。一般情況下，隨著群體規(guī)模的增加，MAS取得的效果越好。但是如果群體規(guī)模太大，也會增加實(shí)際選擇的復(fù)雜程度，影響選擇的結(jié)果。因此，要選擇合適的群體規(guī)模，既能達(dá)到理想的選擇效果，又能避免給工作帶來困難。

3.6 選擇的世代數(shù)

MAS選擇的效率不會隨著選擇世代數(shù)的增加而保持不變，相反，選擇世代數(shù)的增加會降低選擇效率。原因是長期的連續(xù)選擇降低了標(biāo)記與QTL之間的連鎖不平衡。

4 分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

4.1 構(gòu)建基因圖譜并進(jìn)行基因定位

基因圖譜是指鑒定控制生物某性狀的基因，并測定它在染色體上的特定位置，然后用圖示的方式把它表示出來。構(gòu)建基因的遺傳圖譜和物理圖譜是為了可以對基因有詳細(xì)地了解和掌握，尤其是某性狀的有利基因，有助于遺傳育種工作的進(jìn)行。構(gòu)建基因圖譜的意義在于了解控制生產(chǎn)性能、繁殖性狀、抗應(yīng)激等性狀的基因結(jié)構(gòu)與功能，采用標(biāo)記輔助選擇或基因型選擇法改良目標(biāo)群體，研究不同動物種間基因組型及進(jìn)化關(guān)系等。目前，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)構(gòu)建了一些動物的基因圖譜，這些圖譜對動物資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供了重要的基礎(chǔ)資料。連鎖群中遺傳標(biāo)記的數(shù)量、均勻度和雜合度決定了遺傳圖譜的質(zhì)量。目前人們在不斷地尋求新的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因圖譜的研究，以提高遺傳圖譜的飽和度，為動物育種標(biāo)記輔助選擇提供豐富的基因圖譜資料。

4.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳距離的分析

通過微衛(wèi)星多態(tài)性的標(biāo)記可以反映出物種的進(jìn)化過程，在1個生物群體中，頻率最高的等位基因是該物種中最原始、保守的基因，其余的等位基因是由該等位基因在物種的進(jìn)化過程中突變而形成的。導(dǎo)致遺傳差異的直接原因在于不同物種在同一個微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)目和頻率的差異，可作為區(qū)分品種類型的依據(jù)。

4.3 雜種優(yōu)勢的預(yù)測

在生物學(xué)上，雜種優(yōu)勢是指雜交子代的生長活力、育性和種子產(chǎn)量等方面都比交配雙親好的現(xiàn)象。利用雜種優(yōu)勢能挖掘種質(zhì)資源的內(nèi)在潛力和更深層次地對種質(zhì)資源進(jìn)行開發(fā)利用，已經(jīng)培育出了許多具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的多品種畜禽?？梢杂肈NA多態(tài)性測定品種或品系間的差異，然后計(jì)算遺傳距離，顯示其他指標(biāo)的測定結(jié)果穩(wěn)定，所以用分子標(biāo)記方法預(yù)測動物的雜種優(yōu)勢也更加準(zhǔn)確。盡管前人在雜種優(yōu)勢預(yù)測方面開展了大量研究工作[10-19]，但是目前的文獻(xiàn)中有利用雜種優(yōu)勢預(yù)測育成雜交種的報(bào)道，雜種優(yōu)勢預(yù)測離育種實(shí)踐尚有相當(dāng)距離。

4.4 性別鑒定

為了更大程度地增加畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)利益，防止連鎖性遺傳病的發(fā)生，得到需要性別的畜禽（如母牛、母雞）需要控制性別，而性別控制的前提是性別鑒定。早期性別鑒定的方法有細(xì)胞遺傳學(xué)法、H-Y抗原法、X染色體連接酶活力測定法。這3種方法各有缺點(diǎn)，缺點(diǎn)分別是操作繁瑣，易損害胚胎，準(zhǔn)確率低等。而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中PCR法和熒光原位雜交技術(shù)（FISH）克服了以上的種種缺點(diǎn)，能夠?qū)ε咛ミM(jìn)行快速、準(zhǔn)確的性別鑒別，從而選擇所需的后代，提高了鑒定的準(zhǔn)確性，在某種程度上可以帶來經(jīng)濟(jì)利益。

4.5 親緣關(guān)系的分析

遺傳物質(zhì)DNA的差異使得生物體各種性狀的表現(xiàn)不同，物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度在一定程度上可由DNA序列的差異來反映。DNA相似度越高，其親緣關(guān)系越近。雖然在基因水平上，第一代個體存在特別微小的差異，但是這些差異會在分化過程中隨著變異的累積而增大。DNA標(biāo)記能夠用于動物品系間親緣關(guān)系的分析和遺傳多樣性的檢測，這些DNA水平的遺傳標(biāo)記在估測物種的起源及群體親緣關(guān)系的研究中，具有較高的檢出率和靈敏度。

4.6 動物的抗病育種

除此之外，還能利用分子標(biāo)記診斷豬的疾病。應(yīng)用分子標(biāo)記的主要目的是尋找與重要經(jīng)濟(jì)性狀和致病基因連鎖的DNA片段，以期能進(jìn)行早期選擇，甚至在出生前就能對性狀進(jìn)行選擇。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與疾病有關(guān)的基因，比如RYRI基因、E.cdiF4受體基因和LA基因，分別位于6號、13號和7號染色體。這些疾病基因的發(fā)現(xiàn)能夠用于抗病育種，提高動物的抗病能力，避免疾病的發(fā)生，減少藥物成本和患病動物的淘汰率，進(jìn)而提高生產(chǎn)效益。

5 MAS在育種中的應(yīng)用

5.1 MAS在山羊中的應(yīng)用

趙苗等[20]以共計(jì)1 006個內(nèi)蒙古白絨山羊、陜北白絨山羊兩個絨山羊品種為材料，應(yīng)用PCR-SSCP、PCRRFLP、aPCR-SSCP、DNA測序技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)和生物信息學(xué)等，研究了KAP基因家族中的4個HGTKAP基因、MTNR1a基因（外顯子2）、SS基因（全CDS區(qū)）共6個候選基因8個基因座的遺傳變異，同時探討絨山羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多態(tài)性及其與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系，并且初步探討了PCRSSCP和aPCR-SSCP兩種方法的優(yōu)劣。結(jié)果表明KAP6.1和KAP8.2基因在陜北絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊群體中都呈單態(tài)，KAP6.2基因中共揭示了2個SNP和1個缺失突變；KAP6.2基因的片段僅在陜北絨山羊群體中存在，并且處于哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡狀態(tài)，而在內(nèi)蒙古絨山羊群體中并沒有檢測到。不同多態(tài)基因座與內(nèi)蒙古絨山羊產(chǎn)絨性狀和抓絨后體重的方差分析表明，KAP6.2基因?qū)Ρ驹囼?yàn)所檢測的性狀沒有影響，KAP8.1基因的不同基因型對毛長性狀有極顯著影響，因此，該試驗(yàn)將KAP8.1基因作為毛長性狀的候選基因；MTNR1a-4-577基因座對內(nèi)蒙古絨山羊的產(chǎn)羔數(shù)有影響顯著，MTNR1a-4-589基因座對羔羊初生重有顯著影響，因此，把MTNR1a-4-577作為產(chǎn)羔數(shù)選擇的標(biāo)記，而MTNR1a-4-589基因座可以作為初生重選擇的標(biāo)記。Gootwine等[21]借助兩個微衛(wèi)星標(biāo)記OarAE101和BM1329（FecB座位緊密連鎖）對FecB進(jìn)行前景選擇，將Booroola羊中的FecB基因利用標(biāo)記信息輔助導(dǎo)入到了Awassi乳用綿羊中來培育高繁殖力綿羊。已經(jīng)報(bào)道了很多采用MAS來研究標(biāo)記對山羊生產(chǎn)性狀的連鎖關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)了影響性狀的優(yōu)勢基因型以及分析基因多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析等，對山羊的遺傳改良具有廣闊的應(yīng)用前景。

5.2 MAS在奶牛中的應(yīng)用

種公牛的培育在養(yǎng)牛生產(chǎn)中具有重要的作用，優(yōu)良種公牛對后代的改良意義重大，采用常規(guī)育種法費(fèi)時費(fèi)力，且成本高。如果利用合適的分子標(biāo)記對后備公牛進(jìn)行早期選擇，不僅可以提高選擇準(zhǔn)確性，而且減少了后裔測定的公牛數(shù)量，因此能夠降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。對奶牛進(jìn)行QTL輔助選擇和常規(guī)選擇的對比，研究表明前者的選擇準(zhǔn)確性高。有研究表明少量的QTL效應(yīng)能解釋性狀的大部分遺傳變異，把這些QTL效應(yīng)應(yīng)用到奶牛的MAS育種體系中，奶牛的育種效率會提高。德國、法國等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)把MAS應(yīng)用到奶牛的早期選擇中，取得了一定的成果，但是在我國應(yīng)用MAS進(jìn)行奶牛的選育還存在一些問題，比如缺乏完整的品種登記制度和完善的生產(chǎn)性能記錄體系、種公牛的培育主要以國外品種為主等。MAS能夠改善遺傳進(jìn)展，適合于種公牛的早期選擇。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和發(fā)現(xiàn)更多的分子標(biāo)記，MAS在奶牛的育種中發(fā)揮著重要的作用。

5.3 MAS在豬中的應(yīng)用

已有一些標(biāo)記主基因正被用于豬的分子標(biāo)記輔助育種，比如PIC育種公司已經(jīng)把雌激素受體基因（ESR基因）、促卵泡素β亞基基因（FSHβ基因）的MAS納入了分子育種計(jì)劃，提高豬的繁殖性能。更多的主基因在基因效應(yīng)和精確定位上還達(dá)不到MAS的要求，所以無法在育種工作中使用。李婭蘭等[22]研究了標(biāo)記輔助選擇在豬育種中應(yīng)用效果，結(jié)果顯示MAS對低遺傳力、限性性狀的選擇效率最高；當(dāng)性狀的QTL方差占遺傳方差基本相同時，中等遺傳力性狀的選擇效率比高遺傳力性狀的選擇效率更高；隨著有利等位基因起始頻率的升高，選擇效率下降，而且有利等位基因起始頻率越低，選擇效率下降速度越快。

6 小結(jié)

在動物育種中，分子標(biāo)記發(fā)揮著重要的作用，并形成了分子育種這一新的領(lǐng)域。MAS現(xiàn)在已經(jīng)成為了動物育種常用的方法之一，不僅能縮短世代間隔，增強(qiáng)選擇強(qiáng)度，提高選擇的準(zhǔn)確性和效率。而且選擇不受時間、環(huán)境、年齡等的限制，適合于目標(biāo)品種的早期選擇，對于群體的遺傳改良具有重要作用。然而，利用MAS實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培育新品種的目標(biāo)現(xiàn)階段還沒有實(shí)現(xiàn)，其真正在育種實(shí)踐中應(yīng)用還需要大量的研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

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（以下參考文獻(xiàn)若有需要可與作者聯(lián)系）

宋志芳（1992-），女，山東菏澤人，研究生，研究方向：動物遺傳育種，

E-mail：18730285576@163.com