通過生化和蛋白組學(xué)分析探究應(yīng)激標記

李岑岑（譯）

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

通過生化和蛋白組學(xué)分析探究應(yīng)激標記

李岑岑（譯）

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

薦語：隨著全球畜牧業(yè)發(fā)展和國際貿(mào)易自由化、規(guī)范化進程加快，動物福利越來越受到關(guān)注，故客觀評估動物的福利水平至關(guān)重要。然而，目前的研究大多局限于基于動物表型以檢測動物的福利水平，而評估動物福利水平的實驗室生物標記信息很少，本文對不同飼養(yǎng)密度下母豬的應(yīng)激進行了生化與蛋白組學(xué)分析，以期獲得一套客觀且易于檢測的實驗室參數(shù)用于動物福利的評估。

1 研究背景

妊娠期間母豬通常被安置于單個畜欄，這樣母豬易于管理，其群體應(yīng)激減少，且易飼喂。然而，福利專家認為這種單獨的飼養(yǎng)系統(tǒng)會對動物產(chǎn)生應(yīng)激，對動物是有害的，因此，歐盟已經(jīng)禁止這種做法。妊娠母豬的限位欄飼養(yǎng)使其活動空間有限，容易發(fā)生皮膚擦傷、行動困難、肌肉質(zhì)量下降和骨抗壓力喪失等現(xiàn)象。此外，相比于群養(yǎng)的母豬，單獨飼養(yǎng)的母豬更容易發(fā)生異常的行為和繁殖問題。

盡管客觀評估應(yīng)激很重要，但是其實驗室生物標記的信息很少，有些文章已經(jīng)評估了基于動物表型的有效性以檢測母豬的福利。如假裝咀嚼或過度飲水的行為表明單獨飼養(yǎng)的母豬在單個畜欄有所不適。不過我們也觀察到相反的結(jié)果，雖然限位欄飼養(yǎng)的母豬其打斗行為和假咀嚼行為很容易發(fā)生，但是群居母豬的飲水頻率要比單畜欄飼養(yǎng)的母豬高。

因此，獲得一套客觀且易于檢測的實驗室參數(shù)作為福利評分將是檢測動物福利的一個重要因素。動物行為、生物化學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)的互補性以及現(xiàn)代高通量技術(shù)的使用有助于為動物的飼養(yǎng)和管理創(chuàng)造更全面的科學(xué)基礎(chǔ)。

我們小組以前的研究已經(jīng)定義了潛在的實驗室標記來評估不同飼養(yǎng)密度下公豬的應(yīng)激。我們的第一個研究目的是評估飼養(yǎng)環(huán)境變化后母豬的代謝和激素標志物，我們對急性期反應(yīng)（AP）和氧化應(yīng)激通路相關(guān)的蛋白也進行了分析。第二個研究目的是拓展2D-DIGE和iTRAQ標記蛋白組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用空間以尋找新的應(yīng)激相關(guān)的血清標記。

2 方法

2.1 試驗設(shè)計

試驗材料為6月齡的后備母豬（長白×大白×杜洛克）60頭，10頭為一組。后備母豬被轉(zhuǎn)移到單畜欄的第1天隨意進食，每個畜欄大約飼喂2.5 kg的飼料。試驗豬只分為兩組，一組是HS組（n=15）在1 d（D1）、3 d（D3）、4 d（D4）、5 d（D5）對其進行采樣（樣品數(shù)為15乘4是60），該組母豬主要受到單畜欄飼養(yǎng)和重復(fù)取樣兩種應(yīng)激；H組包括3個亞單位組，在3 d（n=15）、4 d（n=15）或5 d（n=15）對其進行采樣（樣品數(shù)為15乘3是45），接受單畜欄飼養(yǎng)和非重復(fù)取樣兩種應(yīng)激，因此參與后期分析的樣品數(shù)為105。這種設(shè)計使我們能區(qū)別重復(fù)取樣和單畜欄飼養(yǎng)所產(chǎn)生的應(yīng)激，不會干擾全進全出的管理模式。本試驗設(shè)計中，第1天測量的參數(shù)對應(yīng)于基礎(chǔ)水平。

2.2 樣本采集和準備

上午9點到11點通過頸靜脈穿刺采取后備母豬的血樣，并放在無抗凝血劑（血清）或含有EDTA-K3（細胞裂解物和脫蛋白血液）的管中。2 000 r/min離心10 min獲得血清，離心后制備紅細胞裂解液，用0.9%的NaCl洗滌細胞沉淀，用冷凍的去離子水裂解。將血液和5%偏磷酸混合，然后3 000 r/min離心5 min獲取脫蛋白血液。通過使用小母豬自發(fā)咀嚼棉簽30～60 s收集唾液樣品，將棉簽4 000 r/min離心10 min。所有離心均在室溫下進行，將上清液冷凍在-80 ℃保存，直至分析。

2.3 參數(shù)分析

血清非酯化脂肪酸（NEFAs）、甘油三酯和膽固醇被確定為脂質(zhì)代謝的標志物。血清總蛋白、尿素和肌酐被確定為蛋白質(zhì)代謝的指標。用分析儀Olympus AU400測量代謝參數(shù)。所有的參數(shù)分析都進行重復(fù)分析。

2.4 免疫印跡

通過印跡法檢測羰基蛋白質(zhì)含量，通過免疫印跡檢測血清載脂蛋白A-I（Apo A-I）。在兩種免疫測定中使用對照樣品來比較來自不同膜的結(jié)果。計算樣品和對照蛋白條帶之間的比率。

2.5 蛋白組學(xué)分析

通過2D-DIGE和iTRAQ對D1、D3和D5的血清樣品混合進行發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2.6 生化數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析使用SAS系統(tǒng)V.9.1.3（SAS Institute，Cary，NC，USA）進行。對于所有生化分析，使用個體豬作為試驗單位。當(dāng)未指定時，顯著性水平（α）設(shè)定為0.05。沒有進行剔除異常值的測試。包括在統(tǒng)計分析中的變量是連續(xù)的。Shapiro-Wilk和Levene檢驗分別用于評價變量分布的正態(tài)性和方差齊性。選擇非參數(shù)（Wilcoxon檢驗）來比較在D1（基礎(chǔ)水平）和H和HS組的其余天數(shù)之間的所有測量參數(shù)獲得的結(jié)果。使用H和HS組之間的非參數(shù)（Wilcoxon檢驗）進行重復(fù)取樣對參數(shù)的影響。

3 結(jié)果

3.1 一般生化分析

結(jié)果顯示：兩組中在D3都觀察到非酯化脂肪酸（NEFA）瞬時增加，在D4迅速恢復(fù)正常水平；在研究結(jié)束時甘油三酯（TG）顯著增加；總膽固醇除了在HS組中D3增加之外，在其他時期沒有變化；除了H組D5觀察到較低水平的NEFA，在HS和H組之間沒有觀察到任何脂質(zhì)標志物的差異。兩組的尿素在D4和D5下降。兩組中的肌酸酐在D3均增加，僅在H組D4和D5增加。在D3和D4轉(zhuǎn)換到單畜欄后，血清總蛋白濃度增加。HS和H組之間沒有差異。在血清中測量肌酸激酶（CK）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）酶活性并作為肌肉（CK和ALT）或肝損傷（ALT和ALP）的標志物。發(fā)現(xiàn)CK和ALT活性在個體間的變異很大。在HS組中觀察到CK在D3增加。在血清和唾液中測定皮質(zhì)醇作為應(yīng)激標志物。該參數(shù)具有較大的個體間變異性，特別是在唾液中。

3.2 先天免疫系統(tǒng)和氧化應(yīng)激防御監(jiān)控

整個研究中H和HS組豬急性期反應(yīng)蛋白水平發(fā)生變化，觸珠蛋白（Hp）在D3稍微增加并且隨后恢復(fù)到正常水平。C-反應(yīng)蛋白（CRP）僅在HS組中D3增加，而在相同動物組中Apo A-I僅在D3處降低。H組和HS組改變飼養(yǎng)環(huán)境后氧化應(yīng)激標記物發(fā)生了不同的變化：在H組中，谷胱甘肽過氧化物酶活性（GPx）在D4增加，超氧化物歧化酶（SOD）在D5增加，在tGSH和蛋白質(zhì)-羰基中觀察到輕微增加。HS和H組之間僅在D4和D5觀察到GPx存在顯著的差異，在D5觀察到SOD存在顯著差異。

3.3 蛋白組學(xué)分析

通過2D-DIGE和iTRAQ分析蛋白質(zhì)組變化。結(jié)果表明：在H和HS組的D3和D5存在差異表達。

3.4 2D-DIGE

在H和HS組中的D3發(fā)現(xiàn)Hp，α1抗胰凝乳蛋白酶3和PRDX2顯著增加，而Apo A-I顯著降低。所有四種蛋白質(zhì)在D5漸漸恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

3.5 iTRAQ

8重iTRAQ分析鑒定了262種蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)的總體分析反映了釋放到血流中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的輕微增加和許多細胞外蛋白質(zhì)的相對減少（基因本體分析，數(shù)據(jù)未顯示）。為了抵消這種蛋白質(zhì)偏倚，對iTRAQ數(shù)據(jù)進行標準化。

在D3有67個蛋白減少，54個蛋白增加。大多數(shù)蛋白質(zhì)在HS組中顯示比H組更大的倍數(shù)變化，并且在D3比在D5產(chǎn)生更大的倍數(shù)變化。

在差異表達的蛋白質(zhì)中，其中有兩個蛋白在2D-DIGE分析也得到了：在D3和D5發(fā)現(xiàn)ApoA-I減少并且PRDX2增加。還通過iTRAQ鑒定了其他功能相關(guān)蛋白，例如載脂蛋白C-III，E，M和R（脂質(zhì)轉(zhuǎn)運）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）同種型3（抗氧化防御）。另一組具有相關(guān)功能的差異表達的蛋白質(zhì)與免疫系統(tǒng)相關(guān)，包括乳鐵蛋白，protegrin 3和半乳凝素1，其在H組和HS組中在D3增加，并且在D5恢復(fù)基礎(chǔ)水平。最后，另一個相關(guān)的蛋白質(zhì)組是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如肌動蛋白結(jié)合蛋白，微管蛋白，參與糖酵解的酶和幾個蛋白酶體亞基，這些蛋白在血清中水平增加。

4 討論

在所有樣品（樣品數(shù)=105）中進行詳細的生物化學(xué)分析，并且進行兩種蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于鑒定該應(yīng)激條件的新的潛在標記物。

生化分析表明小母豬在試驗過程中是健康的。NEFA水平表明D3脂肪的脂質(zhì)水平增加，而研究結(jié)束時兩個動物組中的TG的增加表明后備母豬適應(yīng)新的環(huán)境并且標準化它們的食物攝入。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中也觀察到脂質(zhì)代謝的變化。這些觀察結(jié)果證實改變的脂質(zhì)代謝與生理應(yīng)激相關(guān)，可能是受腎上腺素和皮質(zhì)醇的脂解活性的結(jié)果。

應(yīng)激，日糧的改變也可能會加速母豬蛋白質(zhì)的分解代謝。由于血液提取過程中組織損傷可能會導(dǎo)致HS組骨骼肌標記CK增加。骨骼肌中含有豐富的CK和ALT，這兩種物質(zhì)之間存在強相關(guān)性（r=0.785）。關(guān)于氧化應(yīng)激，H組的小母豬比HS組的小母豬具有更高的抗氧化活性。重復(fù)采血可能通過減少抗氧化劑防御或提高活性氧（ROS）來增加HS小母豬的氧化應(yīng)激程度。

兩種不同的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，表明HS組中的蛋白質(zhì)組成比H組中的發(fā)生更大的變化，證明反復(fù)取樣和居住環(huán)境/飲食改變的后備母豬會受到更大的挑戰(zhàn)。

蛋白質(zhì)組學(xué)還表明發(fā)生了一定程度的細胞損傷，導(dǎo)致血漿中細胞蛋白質(zhì)的相對增加，例如肌動蛋白結(jié)合蛋白、微管蛋白、參與糖酵解的酶和幾個蛋白酶體亞基。這些蛋白質(zhì)中有些是潛在的優(yōu)秀標記物，因為它們在血清中大量增加。由于單畜欄會減小空間，進而引起相關(guān)的物理損傷，可以增加細胞滲漏。有趣的是，已經(jīng)報道過細胞質(zhì)蛋白β-肌動蛋白是圈養(yǎng)中的應(yīng)激生物標志物。然而，只有在更多數(shù)量的個體和不同的應(yīng)激條件下對這些蛋白進行徹底的驗證，才能被認為是足夠的生物標志物。

在所有情況下（生化標記物和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果），在H和HS組中觀察到的血清分析變化發(fā)生相同的變化。HS組中所有的變化總是比H組的變化大，更加說明在受到兩種類型的應(yīng)激后后備母豬損傷更重要。

需要進一步的研究以確認差異表達的蛋白可以作為應(yīng)激生物標志物，并表征其特異性，敏感性和代謝動力學(xué)。

5 結(jié)論

母豬飼養(yǎng)于單畜欄會促進其血清組成的相關(guān)變化，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分解代謝和氧化應(yīng)激的增加，先天免疫系統(tǒng)的激活，可能引起組織損傷。因此，我們建議將血漿脂質(zhì)標志物、APP或其他先天免疫指標、氧化還原成分、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和唾液皮質(zhì)醇的綜合信息作為豬福利的評判指標。

（原文作者及鏈接：Anna Marco-Ramell,Laura Arroyo,Raquel Pe a,Raquel Pato,Yolanda Saco,Lorenzo Fraile,Em ke Bendixen and Anna Bassols；http://bmcvetres. biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0887-1）

2017-01-16）