基因芯片技術(shù)及其在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用概述

陸 曼 李博巖王旭平 柳誠剛 譚 斌 楊汝才

基因芯片技術(shù)及其在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用概述

陸 曼 李博巖*王旭平 柳誠剛 譚 斌 楊汝才

1 基因芯片技術(shù)的發(fā)展歷史

基因芯片（gene chip）亦稱 DNA 芯片， 主要是指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)， 用以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、準(zhǔn)確、大信息量檢測。隨著人類基因組計(jì)劃（HGP）的實(shí)施，基因芯片應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新。

基因芯片的原型是在 20 世紀(jì) 80 年代中期出現(xiàn)的，它依據(jù)計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體芯片制作技術(shù)中晶體管集成在芯片上這一原理， 將寡核苷酸分子集成在芯片上而制成。Bains 等運(yùn)用雜交的方法將短的 DNA 片段固定在支持物上， 并借助雜交原理對其序列進(jìn)行了測定?；蛐酒嬲龔膶?shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化得益于照相平版印刷技術(shù)與探針固相原位合成技術(shù)的結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)。這些技術(shù)的引入使數(shù)以萬計(jì)的高密度探針分子的合成與固定成為可能， 而激光共聚焦顯微掃描技術(shù)也有可能讓雜交信號的準(zhǔn)確、實(shí)時、靈敏的檢測和分析成為現(xiàn)實(shí)。1990 年， 美國 Affmetrix 公司的 Fodor 等通過實(shí)驗(yàn)把一種光敏材料涂布在硅芯片表面，通過光蝕刻技術(shù)原位合成了多肽鏈。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)odor 等進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn)，最終率先合成了 DNA 陣列。1997 年，斯坦福大學(xué) Brown 實(shí)驗(yàn)室研制出了世界上第一張全基因組芯片。此芯片是酵母全基因組芯片， 具有 6166 個基因， 它的研制成功開創(chuàng)了基因芯片技術(shù)應(yīng)用的先河。

1970 年以后，隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等新興學(xué)科的迅猛發(fā)展及人們消費(fèi)觀念的改變，動物育種目標(biāo)由單一的常規(guī)育種向分子與常規(guī)聯(lián)合育種轉(zhuǎn)變，肉用性能相關(guān)基因的篩選成為研究熱點(diǎn)。基因芯片及熒光定量 PCR 技術(shù)的出現(xiàn)為肉牛肉質(zhì)性狀的系統(tǒng)研究提供了強(qiáng)有力的手段。

2 基因芯片簡介

2.1 基因芯片的原理

基因芯片是建立在雜交測序技術(shù)和基因探針上的一種高效快速的核酸序列分析工具。雜交測序是基因芯片的測序原理。此方法是將大量的基因探針高密度地、有序地排列在一塊 1～2 cm2大小的載體上， 隨后用標(biāo)記的待測樣品與之雜交， 通過分析檢測雜交信號的分布及強(qiáng)度便可以獲得樣品中待測 DNA 的各種數(shù)據(jù)。

2.2 基因芯片的類型

基因芯片可以分為三種類型:①用聚合物基片（硝酸纖維膜或尼龍膜等）制成的芯片。這種芯片的核酸探針或 cDNA 片段被固定在聚合物基片表面上，檢測時同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，之后采用放射顯影技術(shù)進(jìn)行分析檢測。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以方便地使用目前分子生物學(xué)常用的放射顯影技術(shù)及其所需檢測設(shè)備，檢測技術(shù)比較成熟；缺點(diǎn)是芯片上的探針密度不高，要使用大量的試劑和樣品， 不完全適合于定量檢測。②用玻璃板作為探針的載體制成的芯片。這種芯片的 DNA 探針陣列是用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的，檢測時將熒光標(biāo)記的靶基因與玻璃板上探針進(jìn)行雜交，然后檢測雜交分子的熒光數(shù)據(jù)， 便可獲得靶基因的相關(guān)資料。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是大大提高了探針的密度，有利于獲得比較高的檢測精度；缺點(diǎn)是批量化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)方面仍有較多困難。③用玻璃或其他硬質(zhì)材料薄片作為探針的載體制成的芯片。這種基因芯片的寡核苷酸探針陣列可在載體表面上直接合成，檢測時將熒光標(biāo)記的靶基因與寡核苷酸探針雜交，并進(jìn)行后續(xù)的熒光檢測，便能獲得靶基因的各種數(shù)據(jù)。此方法是把 DNA 化學(xué)合成技術(shù)與微電子光刻技術(shù)相結(jié)合，優(yōu)點(diǎn)是大大提高了基因芯片探針的密度， 可以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，有很大的發(fā)展空間。

2.3 基因芯片的優(yōu)點(diǎn)

基因芯片有以下優(yōu)點(diǎn): ①使在同一條件和時間下需要多次處理的遺傳分析能快速完成，有很強(qiáng)的類比性；②細(xì)胞、組織、血液等的基因表達(dá)信號的定量、定性分析可以在同一張芯片上獲得，并還可以實(shí)現(xiàn)時間與空間上、全局檢測靜態(tài)到動態(tài)的差異及遺傳信息的檢測，有很大的信息產(chǎn)出率；③有較強(qiáng)專一性和高度的敏感性， 可以精準(zhǔn)和可靠測定 10pg /μL 的 DNA 樣品；④尼龍膜制作的微陣列， 可重復(fù)進(jìn)行多達(dá) 20 次雜交實(shí)驗(yàn)， 有很好的重復(fù)使用性；⑤已有的芯片面積最小的僅有 1 cm2， 最大的也不超過525cm2，所以每個陣列中 DNA 樣品的用量較少， 反應(yīng)體積和試劑用量也相應(yīng)地大大減小， 但反應(yīng)效率卻提高了百倍，有利于實(shí)現(xiàn)測量的自動化和微型化；⑥基因芯片技術(shù)容易與其他技術(shù)相互交叉使用。

2.4 基因芯片技術(shù)的操作流程

生物芯片技術(shù)操作流程主要包括四個步驟: ①芯片方陣的構(gòu)建: 將玻璃片或硅片作表面處理，并將蛋白質(zhì)分子或 DNA 片段按順序排列在芯片上；②樣品的制備: 獲取生物樣品中的DNA、蛋白質(zhì)或 RNA 并對其做標(biāo)記， 可以大大提高檢測的靈敏度（一般情況下，待測材料不能直接與芯片反應(yīng)，只有少數(shù)的特殊樣品除外）；③生物分子反應(yīng): 芯片檢測的關(guān)鍵是芯片上的生物分子之間的反應(yīng)， 應(yīng)當(dāng)選擇最合適的反應(yīng)條件， 使生物分子間反應(yīng)條件處于最佳狀況，從而使生物分子之間的錯配比率大大降低；④芯片信號的檢測: 將芯片置入芯片掃描儀中是常用的芯片信號檢測方法，掃描后便可獲得有關(guān)生物信息。

3 基因芯片在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用

3.1 牲畜基因表達(dá)水平的檢測

對于基因的保守片段設(shè)計(jì)了多對完全與之匹配的寡核苷酸探針（PM）以及相應(yīng)的中心單堿基錯配的寡核苷酸探針（MM），將它們固定在芯片的相鄰位置上， 便可用來對標(biāo)記的樣品靶序列進(jìn)行雜交探測。陽性情況下（正常完全匹配），PM 的雜交信號明顯強(qiáng)于 MM 的雜交信號；而假陽性時（錯配），兩者的雜交信號差異不明顯。所以， PM/ MM（PM 與 MM 的信號比值）可作為衡量陽性的指標(biāo)，當(dāng)某一基因三條以上探針呈陽性時， 可定性判斷閑逛基因的表達(dá)。而通過比對異常和正常樣品雜交信號，則可檢測不同樣品中基因表達(dá)水平的變動趨勢。

這方面的研究已有不少報(bào)道。朱正茂等以杜洛克豬胎兒骨骼肌 5 個不同發(fā)育時期的背最長肌作樣本研究其基因表達(dá)譜，并對結(jié)果進(jìn)行聚類分析， 獲得了骨骼肌發(fā)育的變動信息。Lin 等運(yùn)用由 9182 個 cDNA探針構(gòu)成的基因表達(dá)譜芯片對杜洛克和桃園豬骨骼肌表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)杜洛克豬中與轉(zhuǎn)率調(diào)控蛋白、肌原纖維蛋白、能量代謝酶相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)， 解釋了杜洛克在出生后比桃園豬具有更高的肌肉增長率的作用機(jī)制。Ushizawa 等根據(jù)牛肝臟 cDNA 序列制備了代表 2059 個?；虻男酒?， 并檢測了妊娠?；蜣D(zhuǎn)錄差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在懷孕第 27 ～ 28 d 時大多肝臟基因被誘導(dǎo)表達(dá)。Yao 等用卵母細(xì)胞 cDNA 文庫建立了基因芯片，為卵泡發(fā)育和早期胚胎發(fā)育機(jī)理的研究提供了有力的工具。張國梁等利用基因芯片技術(shù)構(gòu)建了中國草原紅牛公牛與閹牛差異基因表達(dá)譜。

3.2 獸藥篩選和新獸藥的開發(fā)

基因芯片技術(shù)可以用來鑒定和分離藥物的有效成分， 解決了目前獸藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)遇到的重要困難。很多獸藥是直接或者間接地通過改變、修飾動物基因的表達(dá)或基因表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效。所以， 可通過基因芯片技術(shù)分析動物機(jī)體用藥前后的不同器官、組織基因表達(dá)的差異， 從眾多藥物成分中篩選出真正起作用的組分物質(zhì)?；蛐酒夹g(shù)在藥物篩選方面有著巨大的優(yōu)勢， 因?yàn)樵摷夹g(shù)具有大規(guī)模、高通量、平行性地分析基因表達(dá)的能力。利用基因芯片技術(shù)作大規(guī)模的篩選研究可以縮短藥物篩選所用時間，節(jié)約大量的動物實(shí)驗(yàn)， 降低風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用， 大大提高效率。

3.3 畜禽疾病的診斷

伴隨著畜牧業(yè)的發(fā)展， 動物傳染病的流行變得更加復(fù)雜，畜禽疾病的診斷和防治也隨之更加困難。傳統(tǒng)的診斷方法雖然可靠， 但是每次只能檢測一種病原；而生物芯片能一次檢測多種病原，而且具有需要樣品量少、特異、靈敏、快速和費(fèi)用低廉的優(yōu)勢。

基因芯片在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究的報(bào)道很多。美國科羅拉多大學(xué)與疾病控制和預(yù)防中心研發(fā)的“M 基因芯片”，采用流感病毒基因模版， 可快速檢測各種流感病毒，其中包括 H5N1 型高致病性禽流感病毒， 可輕易將 H5N1 型禽流感病毒與普通感冒病毒相區(qū)分。陳鳳梅等應(yīng)用 RT － PCR 或 PCR 方法分別獲得雞禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎等 14 種家禽疾病的病原核酸特異性片段，并以這些片段為探針， 采用接觸式電樣技術(shù)制成低密度的 DNA 陣列芯片，同時成功檢測了這 14 種禽類傳染病， 驗(yàn)證了該新穎 DNA 陣列芯片的良好檢測效果。

3.4 園林觀賞動物的DNA測序

HGP 計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的自動化測序方法的發(fā)展， 基因芯片利用固定探針與樣品之間分子雜交產(chǎn)生的雜交譜而排列出待測樣品的序列，此測序法比傳統(tǒng)的 Sanger 雙脫氧鏈終止法快速且前景誘人。

例如，美國 Affymetrix 公司于 1998 年生產(chǎn)的帶有13.5 萬個基因探針的芯片，使人類 DNA 的解碼速度比原來提高了 25 倍。Mark chee 等用帶有 13.5 萬個寡核苷酸探針陣列測定了全長為16.6 kb 的人線粒體基因組，其準(zhǔn)確率高達(dá) 99% 。Hacia 等也曾用含 4.8萬個寡核苷酸的高密度微陣列分析了人與黑猩猩BRCA1 基因序列的不同，發(fā)現(xiàn)在該基因外顯子中的部分核酸序列同源性為83.5% ～ 98.2% 之高 ，揭示了兩者在進(jìn)化上的高度一致性。

3.5 尋找牲畜新基因

研究表明， 在序列信息缺乏的條件下，可采用基因芯片技術(shù)尋找新基因。Chitko －McKown 等研究了牛巨噬細(xì)胞基因用脂蛋白（LPS）處理過后表達(dá)的變化情況。他們將人的基因芯片與反轉(zhuǎn)錄的牛巨噬細(xì)胞基因的 cDNA 進(jìn)行雜交， 發(fā)現(xiàn)有 44個基因的表達(dá)存在差異，其中有 18 個基因是牛的巨噬細(xì)胞新基因。Dvorak 等在研究豬腸黏膜的派伊爾氏淋巴集結(jié)功能的分子機(jī)制時采用了基因芯片技術(shù)。研究表明在 3687 個表達(dá)序列標(biāo)簽 （ESTs）中出 現(xiàn)了2414 個特異核苷酸序列， 其中至少有 371 個基因是新基因。Schena 等將熱休克作用和佛波酯處理的 T細(xì)胞的 cDNA 與包含1056 個 cDNA 的芯片雜交， 得到了 4 個新基因。

3.6 畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗性等基因的篩選及優(yōu)良雜種后代選育

畜禽的基因型決定不同性狀的表型， 是由單一或眾多基因相互協(xié)同作用的結(jié)果。畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等性狀可能是質(zhì)量性狀也可能是數(shù)量性狀。通過分子生物學(xué)方法， 已經(jīng)找到了很多由單一基因控制的性狀，但其對于鑒定由多基因控制的多態(tài)性變化與畜禽表型的關(guān)系， 以及發(fā)現(xiàn)更多的有用基因則顯得無能為力。通過采用基因芯片技術(shù)使快速發(fā)現(xiàn)具有重要應(yīng)用價值的新基因以及研究基因表達(dá)的多態(tài)性成為可能，為傳統(tǒng)分子生物學(xué)研究提供了新的工具和思路。通過制作全基因組芯片， 可以在多樣本大群體中快速識別與相關(guān)性狀和功能有關(guān)的特殊功能基因， 從而為物種改良、新品種選育、加快育種進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。在育種過程中選擇優(yōu)良雜種后代， 最困難的一步是從大量的雜交組合群體中篩選具有目的基因的優(yōu)良雜合體或者純合體， 從而選育出具有優(yōu)良性狀或者符合育種目的的目標(biāo)個體。利用基因芯片技術(shù)， 可簡化傳統(tǒng)的育種程序，通過制作帶有篩選目的基因的芯片，采集分離出來的畜禽基因， 不再需要通過繁雜的辛勤的育種工作和長時間的選擇， 就可以實(shí)現(xiàn)從雜種后代中篩選出優(yōu)良個體，并育成新品種的過程。因此， 通過基因芯片技術(shù)，可以改變傳統(tǒng)育種工作模式， 使畜禽遺傳育種工作變得簡單、高效、快速、精確。李艷華等采用基因芯片技術(shù)以及其他相關(guān)技術(shù)，篩選出了與豬群的鮮肉產(chǎn)品的感觀質(zhì)量及其加工性狀、胴體組成、脂肪的質(zhì)量性狀（包括脂肪含量、嫩度、肉色、肌纖維直徑、大理石紋等）等肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳效應(yīng)和主基因關(guān)聯(lián)十分明顯的遺傳標(biāo)記。

4 展望

基因芯片技術(shù)多學(xué)科及相關(guān)技術(shù)融合的結(jié)果， 已經(jīng)廣泛用于基因表達(dá)研究、基因診斷、發(fā)現(xiàn)新基因、基因組研究及各種病原體的診斷等領(lǐng)域。當(dāng)前， 應(yīng)用該技術(shù)成本還比較高， 因此推廣應(yīng)用受到一定的局限。

但隨著計(jì)算機(jī)處理軟件的進(jìn)一步開發(fā)利用， 基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，基因芯片的成本會越來越低， 基因芯片一定會得到越來越多的應(yīng)用。相信在不久的將來，基因芯片技術(shù)一定會成為畜牧業(yè)研究的常規(guī)手段， 為畜牧業(yè)發(fā)展助力。

摘自《生物學(xué)教學(xué)》2017年第9期