影響體外鼠胚試驗標(biāo)準(zhǔn)化的要素分析

史建峰，韓倩倩，王春仁

(中國食品藥品檢定研究院,醫(yī)療器械檢定所,生物材料室，北京 102629)

影響體外鼠胚試驗標(biāo)準(zhǔn)化的要素分析

史建峰，韓倩倩*，王春仁*

(中國食品藥品檢定研究院,醫(yī)療器械檢定所,生物材料室，北京 102629)

不孕癥已成為影響人類生殖健康的全球性問題，作為治療不孕癥的一種重要治療手段，輔助生殖技術(shù)經(jīng)過幾十年的發(fā)展已經(jīng)獲得長足進(jìn)步。輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，對此類產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險管理，制定相應(yīng)的安全性評價檢測方法已勢在必行。2016年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1434-2016《人類體外輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械體外鼠胚試驗》已經(jīng)發(fā)布，本文就體外鼠胚試驗中的關(guān)鍵節(jié)點和試驗體系要素進(jìn)行簡要綜述。

輔助生殖技術(shù)；體外鼠胚試驗；2-細(xì)胞阻滯；醫(yī)療器械

1 引言

生態(tài)環(huán)境惡化、生活節(jié)奏加快和工作壓力增加導(dǎo)致不孕癥的發(fā)病率升高，已成為全球性問題，在發(fā)展中國家尤為突出。我國不孕癥的發(fā)病率約為15%，數(shù)千萬患者飽受疾病困擾，并由此衍生出更深層的社會問題。人類生殖健康問題催生體外輔助生殖技術(shù)，自第一例試管嬰兒誕生至今，輔助生殖技術(shù)已獲得長足進(jìn)步，應(yīng)用日益廣泛，尤其在發(fā)達(dá)國家，應(yīng)用輔助生殖技術(shù)出生的嬰兒占年度總出生人口的1%以上。同時，輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械市場也得到快速發(fā)展，產(chǎn)品種類、產(chǎn)業(yè)規(guī)模和臨床使用量均呈逐年上漲的趨勢，對輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械的風(fēng)險管理應(yīng)予以高度重視。

2 輔助生殖技術(shù)及相關(guān)醫(yī)療器械

1978年Robert Edwards利用體外受精-胚胎移植技術(shù)(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)培育了世界上第一個試管嬰兒[1]，為不孕癥患者帶來福音。IVF-ET是輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中的一種，ART是指通過對精子、卵子、受精卵和胚胎進(jìn)行操作處理，治療不孕不育的技術(shù)。除了IVF-ET，ART還包括卵子體外成熟(in vitro maturation，IVM)、人工授精(artificial insemination，AI)、胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、精子和胚胎凍融和移植前遺傳學(xué)診斷等技術(shù)。

細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)帶動ART不斷發(fā)展完善的同時，輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械也在迅速發(fā)展。輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械主要包括手術(shù)類器械如取卵針、培養(yǎng)皿、胚胎移植導(dǎo)管等器具耗材類產(chǎn)品和與精子、卵子、受精卵和胚胎接觸的操作液、緩沖液、洗滌液、培養(yǎng)液、保存液和冷凍液等液體類產(chǎn)品。輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械中的液體類產(chǎn)品與配子和合子接觸時間較長，應(yīng)用種類繁多，在風(fēng)險等級較高的產(chǎn)品中液體類產(chǎn)品居多。目前國內(nèi)的液體類產(chǎn)品主要以進(jìn)口為主，取得注冊證的進(jìn)口液體類產(chǎn)品均按照風(fēng)險等級最高的三類醫(yī)療器械進(jìn)行管理。

3 輔助生殖用醫(yī)療器械的安全性評價

輔助生殖技術(shù)的核心環(huán)節(jié)是用人工手段使卵子和精子結(jié)合成受精卵，待發(fā)育成8-細(xì)胞早期胚胎后移入子宮繼續(xù)發(fā)育直至分娩。早期胚胎的質(zhì)量是保證胚胎移植成功和胎兒健康的關(guān)鍵，因此對相關(guān)輔助生殖用醫(yī)療器械進(jìn)行風(fēng)險管理必不可少，建立有效的安全性評價檢測方法也勢在必行。2016年1月國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布了YY/T 1434-2016《人類體外輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械體外鼠胚試驗》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，為輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械的監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持。

4 體外鼠胚試驗

4.1 體外鼠胚試驗

體外鼠胚試驗是指在體外培養(yǎng)體系中，使小鼠的受精卵培養(yǎng)發(fā)育到囊胚的過程，主要包括性腺激素促進(jìn)卵子超排、交配合籠、受精卵采集和體外培養(yǎng)以及囊胚形成率檢測幾個步驟。1956年Whitten成功使小鼠8-細(xì)胞胚胎在體外培養(yǎng)發(fā)育成囊胚[2]，McLaren和Biggers將體外培養(yǎng)得到的囊胚移植入雌鼠子宮獲得成體小鼠[3]，小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)-胚胎移植入母體妊娠-成體小鼠分娩整個試驗體系基本建立，為人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

4.2 2-細(xì)胞阻滯

在大量的科學(xué)試驗中，人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)近交系和封閉群小鼠的受精卵體外培養(yǎng)經(jīng)過第一次分裂后就出現(xiàn)發(fā)育停滯，不再繼續(xù)分裂發(fā)育成囊胚，這種現(xiàn)象稱為2-細(xì)胞阻滯。Whitten和Biggers證明2-細(xì)胞阻滯是由雌鼠的基因型決定的[4]。與近交系和封閉群小鼠相比，近交系雜交F1代小鼠通過2-細(xì)胞阻滯能力大大增強(qiáng)，如B6D2F1、B6AF1和B6D1F1等，而近交系和封閉群雜交的小鼠也會發(fā)生2-細(xì)胞阻滯，如SJL/L，126/Br和DBA等[4，5]。將非阻滯小鼠胚胎細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到阻滯小鼠后可以順利通過2-細(xì)胞阻滯，但是將非阻滯小鼠處于G1期的1-細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)注射給阻滯品系卻不能通過2-細(xì)胞阻滯[6]，提示在這一階段通過2-細(xì)胞阻滯所需的因子沒有表達(dá)，而將非阻滯小鼠處于G1和G2期(非S期)的2-細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可以幫助阻滯小鼠通過2-細(xì)胞阻滯[7]。而在體內(nèi)經(jīng)過一次分裂得到的2-細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)條件下順利發(fā)育成囊胚，并且在體外發(fā)生阻滯的2-細(xì)胞轉(zhuǎn)入到含輸卵管組織塊中，能夠繼續(xù)分裂發(fā)育[8]，有研究證實輸卵管可以提供受精卵發(fā)育到囊胚所需的激素、生長因子和抗氧化物質(zhì)[9]。這些結(jié)果提示2-細(xì)胞阻滯不僅受機(jī)體因素影響，也受到培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控。

4.3 幾種常見的小鼠胚胎培養(yǎng)液

在BMOC2之后，科研人員對培養(yǎng)基進(jìn)行了多次改良衍生出多種培養(yǎng)基，目前常用的有M16、CZB和KSOM三種。上世紀(jì)70年代M16培養(yǎng)基配制成功，通過試驗證明，M16可以支持幾種近交系小鼠(如C3H)和雜交F1代(如B6D2F1)發(fā)育形成囊胚，而很多近交系小鼠在M16中會發(fā)生2-細(xì)胞阻滯。為能使受小鼠胚胎通過2-細(xì)胞阻滯，CZB培養(yǎng)基和KSOM培養(yǎng)基應(yīng)運(yùn)而生其應(yīng)用效果也得到證實[10，11]。培養(yǎng)液的主要能量底物是丙酮酸、乳酸和葡萄糖。丙酮酸是早期卵裂期的主要能量來源[12-14]；乳酸能夠支持2細(xì)胞階段后的胚胎發(fā)育并且培養(yǎng)基中乳酸鹽可以影響丙酮酸鹽的代謝[15]；葡萄糖則為致密化期的主要供能物[16]，CZB培養(yǎng)基在4-細(xì)胞后加入葡萄糖成分，KSOM降低了葡萄糖的濃度，當(dāng)葡萄糖濃度升高時，非阻滯小鼠會發(fā)生2-細(xì)胞阻滯現(xiàn)象[17]。將鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病雌鼠的受精卵和胚胎移植分別給正常假孕雌鼠妊娠14.5 d后發(fā)現(xiàn)胚胎神經(jīng)管畸形率顯著上升，而將正常小鼠2-細(xì)胞在體外高濃度葡萄糖環(huán)境下培養(yǎng)至囊胚再移植給正常小鼠發(fā)現(xiàn)胚胎畸形率沒有上升但是吸收胎和移植成功率卻顯著下降[18]。

4.4 影響小鼠胚胎體外培養(yǎng)的因素

4.4.1 氧含量

培養(yǎng)環(huán)境的氧含量對早期胚胎發(fā)育有重要調(diào)控作用，大氣中氧氣的濃度為21%左右，而哺乳動物細(xì)胞中氧含量卻為2% ～ 8%，已有研究證實在相對比5%氧濃度的培養(yǎng)環(huán)境，20%氧濃度的環(huán)境下哺乳動物囊胚形成率和質(zhì)量都顯著下降[19，20]，高濃度氧導(dǎo)致胚胎發(fā)育延遲及對胚胎發(fā)育的副作用是積累性的，產(chǎn)生的副作用是不可逆的，在人的胚胎體外培養(yǎng)也得到類似的結(jié)果[21，22]。在高氧環(huán)境下加入抗氧化劑后，小鼠胚胎的發(fā)育情況可以得到改善[23]。有研究證明高氧環(huán)境對卵子發(fā)育也有負(fù)調(diào)控作用[24]。培養(yǎng)基中的氧可以影響胚胎對碳水化合物和氨基酸的代謝，并且在致密化前、后階段表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)作用，在致密化前，高氧環(huán)境下胚胎糖酵解和氨基酸代謝水平升高，而致密化后反而降低[25，26]，提示胚胎發(fā)育不僅受營養(yǎng)成分影響還受到營養(yǎng)代謝方式的影響。高氧濃度可以調(diào)控受精卵-囊胚階段基因的表達(dá)和甲基化[27-29]，并且誘導(dǎo)移植前胚胎細(xì)胞衰老標(biāo)志表達(dá)和DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯[30]。

4.4.2 氨基酸

氨基酸在小鼠早期胚胎發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，受精卵在添加Eagles非必需氨基酸的培養(yǎng)基中，囊胚形成率、細(xì)胞數(shù)和孵化率都顯著提升[31]。研究表明在培養(yǎng)體系中加入甘氨酸可以調(diào)節(jié)滲透壓從而促進(jìn)MII 卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟進(jìn)而促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育[32]。但是氨基酸經(jīng)過代謝產(chǎn)生的銨鹽對胚胎發(fā)育是不利的，當(dāng)培養(yǎng)基中的銨鹽濃度達(dá)到75 μmol/L就會對胚胎產(chǎn)生毒性作用，也會影響胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因的表達(dá)[33]。作為培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，谷氨酰胺的代謝是銨鹽的主要來源，科學(xué)家為降低銨鹽的濃度，對谷氨酰胺進(jìn)行修飾，發(fā)現(xiàn)銨鹽的產(chǎn)生很難完全避免，培養(yǎng)基換液可以有效緩解銨鹽對胚胎的毒性作用，研究表明高氧濃度對銨鹽的產(chǎn)生也有促進(jìn)作用[34]。

4.4.3 滲透壓

滲透壓對小鼠胚胎發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用，輸卵管中的滲透壓為290 ～ 310 mOsM[35，36]，CZB和KSOM培養(yǎng)基降低了無機(jī)鹽濃度，使動物對滲透壓敏感性降低，當(dāng)滲透壓升高時，非阻滯小鼠也會發(fā)生阻滯現(xiàn)象[17]，有報道證明滲透壓對胚胎發(fā)育的阻滯效應(yīng)主要是使2-細(xì)胞不能進(jìn)入M期[37]。石蠟油也是胚胎體外培養(yǎng)所需的材料，小鼠從1-細(xì)胞到檢測囊胚形成率所需時間為96 h，石蠟油可以防止培養(yǎng)液蒸發(fā)帶來的滲透壓、pH和溫度對培養(yǎng)發(fā)育的副作用[38]，但是石蠟油對胚胎有一定的毒性[39]。

4.5 培養(yǎng)方法的選擇

哺乳動物胚胎早期體外培養(yǎng)有單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)兩種方式，共培養(yǎng)是將兩種或兩種以上的細(xì)胞在同一環(huán)境下共同培養(yǎng)，通過細(xì)胞通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式相互作用，支持生長的一種培養(yǎng)方式。前文提到將產(chǎn)生阻滯的2-細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含輸卵管組織塊的培養(yǎng)基中可以通過2-細(xì)胞阻滯。有學(xué)者將多種體細(xì)胞共培養(yǎng)，建立更加接近體內(nèi)微環(huán)境的培養(yǎng)體系可以促進(jìn)昆明小鼠的胚胎發(fā)育[40]。在培養(yǎng)方式中可以選擇單一培養(yǎng)或序貫培養(yǎng)，序貫培養(yǎng)是根據(jù)胚胎發(fā)育到不同階段的不同營養(yǎng)需求，采用不同成分的培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。人類輔助生殖的培養(yǎng)基則更加細(xì)化，在配子、合子和囊胚期分別使用不同的培養(yǎng)基，可以有效提高胚胎移植成功率，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。

5 體外鼠胚試驗的標(biāo)準(zhǔn)化

體外鼠胚試驗受內(nèi)因和外因共同作用，內(nèi)因為小鼠遺傳背景，外因為培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法。在培養(yǎng)體系建立、培養(yǎng)成分調(diào)整、試驗儀器耗材改進(jìn)和操作方法優(yōu)化中，研究人員做了大量工作并取得很多成果，但是小鼠自身調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育機(jī)制還有待更加深入的研究。2-細(xì)胞阻滯是體外鼠胚試驗的關(guān)鍵節(jié)點，直接影響試驗成敗，新的標(biāo)準(zhǔn)有1-細(xì)胞和2-細(xì)胞兩種方法可供選擇，其中后者受2-細(xì)胞阻滯的制約相對較小，但是對產(chǎn)品的檢驗工作應(yīng)從實際出發(fā)，根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途、接觸部位和接觸時間合理評估風(fēng)險并選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法。醫(yī)療器械的安全性評價要求試驗體系具備足夠的穩(wěn)定性和敏感性，所以應(yīng)結(jié)合試驗動物、培養(yǎng)體系、培養(yǎng)方法和陽性對照等因素綜合考慮。例如ICR雌鼠超排卵能力強(qiáng)，應(yīng)用此品系小鼠可以減少實驗動物用量，但是ICR屬于阻滯系小鼠，對培養(yǎng)條件要求相對較高。雜交F1代小鼠抗阻滯能力較強(qiáng)，但其成本普遍較高。穩(wěn)定的試驗體系是檢驗工作的基礎(chǔ)，而體系的敏感性是檢驗工作有效、可靠的保證。將近交系、封閉群和雜交F1代小鼠在不同的次優(yōu)級培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)封閉群小鼠相較其他兩者對環(huán)境的反應(yīng)更加敏感[41]。體外鼠胚試驗的主要判定依據(jù)為囊胚形成率和囊胚質(zhì)量，尤其是對囊胚質(zhì)量的評價受檢驗人員經(jīng)驗等主觀因素制約，進(jìn)而研究人員在細(xì)化判定標(biāo)準(zhǔn)中做了更加深入的工作?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為在2-細(xì)胞后合子基因激活(zygotic gene activation，ZGA)，之后Pou5f和Cdx2在小鼠早期胚胎中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，利用轉(zhuǎn)基因動物對關(guān)鍵基因進(jìn)行標(biāo)記并在體外培養(yǎng)中對基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，在微觀層面去評價胚胎發(fā)育是否受到影響[42]。物種間對培養(yǎng)環(huán)境的敏感性有一定差異，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠受精卵在體外優(yōu)化培養(yǎng)體系和較差培養(yǎng)環(huán)境下獲得胚胎與在體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)或是含輸卵管組織塊培養(yǎng)環(huán)境下獲得胚胎相比，在移植成功率方面沒有顯著差異[43]，因此陽性物足夠敏感，與產(chǎn)品相適應(yīng)也是非常必要的。

6 總結(jié)

輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械應(yīng)用于配子-合子-胚胎-胚胎移植的各個階段，產(chǎn)品創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)升級都要求產(chǎn)品安全、有效性評價工作與時俱進(jìn)，與產(chǎn)業(yè)發(fā)展相適應(yīng)。建立穩(wěn)定可靠的評價方法，對現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)和延展，為監(jiān)管工作提供技術(shù)支持，助推行業(yè)發(fā)展是醫(yī)療器械檢驗工作從業(yè)人員的奮斗目標(biāo)。

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Analysis of factors affecting the standardization ofinvitromouse embryo test

SHI Jian-feng, HAN Qian-qian*, WANG Chun-ren*

(Department of Biomaterials, Institute of Medical Device Verification, National Institutes for Food And DrugControl, Beijing 102629, China)

Infertility has become a global problem affecting human reproductive health. As an important treatment for infertility, assisted reproductive technology has made great progress over the past few decades. Rapid development has also taken place in medical devices for human assisted reproductive technology. It is imperative to establish the risk management and safety evaluation system of these products. In 2016, the industry standard YY/T 1434-2016 “HumaninvitroAssisted Reproductive Technology With Medical EquipmentinvitroMouse Embryo Test” was officially released. In this paper, the key notes and elements of thisinvitromouse embryo test are briefly reviewed.

Assisted reproductive technology;Invitromouse embryo assay; 2-cell block; Medical devices

史建峰，男，(1986-)，碩士，主要從事醫(yī)療器械生物學(xué)檢驗工作。Email: shengwushi@163.com

王春仁，男，教授，研究領(lǐng)域為醫(yī)用生物材料和組織工程方面的安全性評價。Email: chunrenwang@263.net; 韓倩倩，女，副研究員，研究領(lǐng)域為高風(fēng)險生物材料和醫(yī)療器械的生物學(xué)評價。*共同通訊

研究進(jìn)展

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0102-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.019

2017-02-08