附子理中丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進展?

甘嘉荷，王 淳，宋志前，寧張弛，馬新玲，劉振麗(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

【綜述】

附子理中丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進展?

甘嘉荷，王 淳，宋志前，寧張弛，馬新玲，劉振麗△
(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

目的：歸納總結(jié)附子理中丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究文獻，為完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：檢索文獻并對臨床使用的附子理中丸大蜜丸、濃縮丸、水蜜丸和片劑的定性鑒別、指紋圖譜、檢查和含量測定等相關(guān)文獻進行歸納和綜述。結(jié)果：處方中5味中藥的顯微鑒別和薄層層析鑒別方法都得到研究。通過指紋圖譜多成分定性定量分析，發(fā)現(xiàn)同一廠家不同批次的質(zhì)量差異較小，而不同廠家的質(zhì)量差異較大；君藥制附子中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿、使藥甘草中甘草苷、甘草酸和甘草次酸都作為含量測定成分進行研究。結(jié)論：應(yīng)根據(jù)附子理中丸組方特點，建立君藥制附子和其他藥味中主要成分的指紋圖譜定性鑒別和多成分含量測定質(zhì)量控制方法，從而保證臨床用藥的安全有效和穩(wěn)定可控。

附子理中丸；定性鑒別；指紋圖譜；含量測定

附子理中丸出自宋5《太平惠民和劑局方》，具有溫中健脾的功效，用于治療脾胃虛寒、脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫，收載于《中華人民共和國藥典》2015年版，由制附子、干姜、炒白術(shù)、黨參、炙甘草組成[1]，臨床上具有較為廣泛的應(yīng)用。目前附子理中丸處方涉及的劑型有大蜜丸、水蜜丸、濃縮丸和片劑，生產(chǎn)廠家較多，其中大蜜丸的生產(chǎn)廠家有23家，水蜜丸的生產(chǎn)廠家有1家，濃縮丸的生產(chǎn)廠家有6家，片劑的生產(chǎn)廠家有1家，有的廠家生產(chǎn)2種劑型，各種劑型的制劑工藝不同。

藥品質(zhì)量是保障其有效性、安全性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵。藥典附子理中丸項下質(zhì)量控制方法，主要采用顯微鑒別法和薄層色譜法進行部分藥味的定性鑒別，檢查項下規(guī)定了烏頭堿限量，含量測定項下僅規(guī)定了佐使藥甘草中的甘草苷最低限量標(biāo)準(zhǔn)，而其君藥制附子為有毒中藥附子的炮制品。因此，為更好地控制附子理中丸質(zhì)量，有文獻報道采用液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜等方法，對附子理中丸進行定性鑒別、指紋圖譜分析、多成分含量和總生物堿含量測定。本文對相關(guān)研究進行綜述，以便為完善附子理中丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 顯微鑒別和薄層色譜鑒別方法研究

附子理中丸各種制劑制備工藝有所不同。其中，大蜜丸和水蜜丸中各藥味均采用原粉入藥，濃縮丸中制附子和部分甘草為原粉入藥，片劑中只有制附子為原粉入藥，可見制附子在所有劑型中都是原粉入藥。對于原粉入藥的中藥，可以利用顯微特征進行定性鑒別。藥典收載了附子理中丸大蜜丸和水蜜丸中3味中藥干姜、黨參和甘草的顯微鑒別方法。另有文獻報道，以類白色的糊化淀粉團塊作為制附子顯微特征，以細(xì)小的草酸鈣針晶長10～32 μm、不規(guī)則地塞在薄壁細(xì)胞中作為白術(shù)的顯微特征[2]。

薄層色譜法是最常用的中藥、中成藥定性鑒別方法。2015版藥典附子理中丸鑒別項下，分別以白術(shù)、干姜和甘草的對照藥材為對照，對處方中這3味中藥進行定性鑒別。高文蘭[3]等采用薄層掃描法，以硅膠GF254薄層板、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸為展開劑，香蘭素-濃硫酸-冰醋酸為顯色劑，在540 nm、700 nm雙波長下建立了干姜、白術(shù)、黨參和甘草4味中藥定性鑒別方法；以堿化氯仿-甲醇為展開劑，碘為顯色劑，在420 nm、760 nm雙波長下建立了制附子定性鑒別方法。

2 指紋圖譜分析方法

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正在由以單成分、單指標(biāo)的質(zhì)量控制方法，向多成分、多指標(biāo)的質(zhì)量控制轉(zhuǎn)變。中藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)越來越多地用于評價中藥產(chǎn)品的真?zhèn)?、質(zhì)量優(yōu)劣、一致性和穩(wěn)定性。張衛(wèi)東[4]課題組采用高分離度快速液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立指紋圖譜，系統(tǒng)分析鑒定了4個廠家12批次附子理中丸中的化學(xué)成分。一共定性鑒別了45個化學(xué)成分，其中GC-MS定性鑒別了15個成分，均來自方中干姜，因其富含揮發(fā)油類成分，在附子理中丸中干姜為原粉入藥，因此保留了原飲片中的揮發(fā)油成分。RRLC-Q-TOF定性了30個化合物，其中正離子模式定性了12個化合物，9個成分為附子中的生物堿，1個為黨參中的成分，2個為白術(shù)中的成分，負(fù)離子模式下定性了18個化合物，均來自方中甘草。通過采用RRLC-Q-TOF和GC-MS指紋圖譜，實現(xiàn)了全面分析鑒定附子理中丸中的化學(xué)成分。指紋圖譜結(jié)合聚類分析顯示，12批次樣品的化學(xué)成分存在一定差異，同一廠家不同批次差異較小，不同廠家差異較大。

孫國祥[5]課題組以市售附子理中丸作為研究對象，采用高效液相色譜法(HPLC)多波長分析方法，建立了附子理中丸融合指紋圖譜的質(zhì)量控制方法。融合10批次附子理中丸4個波長下的指紋圖譜，并導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件，對不同批次的附子理中丸HPLC指紋圖譜進行數(shù)字化評價，以5-羥甲基糠醛峰作為參照物峰，確定了31個共有指紋峰，建立附子理中丸的統(tǒng)一化色譜指紋圖譜，可以更加全面地反映復(fù)方所含化學(xué)信息。研究發(fā)現(xiàn)，不同廠家及批次的附子理中丸在化學(xué)成分和含量上都存在較大差異，可能與投料及生產(chǎn)工藝有關(guān)。部分廠家可能未嚴(yán)格按照處方及制備工藝進行投料和生產(chǎn)[6]。同時該課題組對附子理中丸的HPLC指紋圖譜進行撤藥分析研究[7]，從整體上考察不同配伍情況下方劑中化學(xué)成分的變化。結(jié)果顯示，隨著藥味缺失，指紋圖譜的定量定性相似度也在下降。制附子對全方指紋圖譜定量相似度貢獻很小，干姜在加熱回流的條件下與其他中藥成分有相互作用，生成不溶于水的物質(zhì)，從而降低了其他中藥化學(xué)成分的含量；甘草對全方指紋圖譜的相似度貢獻較大。認(rèn)定從定性定量相似度兩個方面評價指紋圖譜，才能反映中藥和制劑的質(zhì)量。同時還對附子理中丸的大鼠血清HPLC指紋圖譜進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)含藥血清中既有直接入血的藥物成分，又有體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，為明確物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考[6]。

董林毅[8]等采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(NF-κB)和β2腎上腺素能受體熒光素酶活性檢測系統(tǒng)，從而發(fā)現(xiàn)附子理中丸中抗炎和解痙的活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，豬毛菜酚和烏胺2個成分為β2腎上腺素受體激動劑，次烏頭堿、乙酰烏頭堿、人參皂甙Rb2、人參皂甙Rf、人參皂苷Rg2、人參皂甙F1和人參皂甙Ro被認(rèn)為是NF-κB的抑制劑。通過IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗，證實了NF-κB抑制劑的抗炎作用。與傳統(tǒng)指紋圖譜相比，這種生物活性集成指紋圖譜方法是一種非常有效的方法，能提高發(fā)現(xiàn)中藥中潛在活性化合物的篩選和識別功能。

3 檢查

由于附子理中丸的君藥制附子為有毒中藥附子的炮制品，為保證復(fù)方的安全性，2015版藥典附子理中丸和附子理中片的檢查項下，除符合相應(yīng)劑型的有關(guān)規(guī)定外，均收載了薄層色譜法檢測烏頭堿限量的方法[1]，其中有采用重金屬檢查法，對附子理中緩釋片中的重金屬和砷鹽進行檢測[3]。

4 含量測定方法

《中國藥典》2015版附子理中丸含量測定項下，規(guī)定了附子理中丸甘草苷最低限量標(biāo)準(zhǔn)，即小蜜丸每克不得少于0.33 mg，大蜜丸每丸不得少于3.0 mg，水蜜丸每克不得少于0.60 mg，附子理中片則規(guī)定了甘草酸含量每片不得少于0.53 mg[1]。

有關(guān)附子理中丸中成分含量測定的文獻報道，多是對附子理中丸中君藥制附子的成分、佐使藥甘草中的主要成分進行測定，也有對制附子總生物堿含量進行研究。對制附子中的成分，有采用HPLC法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)建立，同時測定1種、3種或4種生物堿含量的方法，所涉及的生物堿包括苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿[9-14]；對甘草中的成分，有采用HPLC法測定甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草次酸含量[1、6、17-19]。

4.1 生物堿成分含量測定

劉永剛[9]建立了通過LC-MS法測定大蜜丸中中烏頭堿(即新烏頭堿)含量的方法，測得3個批次樣品中中烏頭次堿含量范圍在0.12～0.20 mg/丸。索志榮[10]等采用LC～MS法測定濃縮丸中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量，測得3個批次樣品中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量范圍分別在1.17～1.53 μg/丸、0.37～0.42 μg/丸和1.11～1.57 μg/丸。鐘碧華[11]等建立了HPLC法測定大蜜丸中烏頭堿含量的方法，測得3個批次樣品中烏頭堿含量范圍在8.255～8.321 μg/g。朱瑞龍[12]等采用HPLC法測定大蜜丸中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量，測得3個批次樣品中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量范圍分別在0.101～0.121 mg/g、0.0243～0.0 277 mg/g和0.0043～0.0 048 mg/g。邵峰[13]同樣采用HPLC法測定濃縮丸和大蜜丸中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿含量，測得4個批次濃縮丸樣品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿含量范圍分別在1.6～7.9 μg/丸、0.1～0.3 μg/丸和3.9～20.8 μg/丸，測得3個批次大蜜丸樣品中苯甲酰新烏頭原堿含量范圍在5.7～17.1 μg/丸，未檢測到大蜜丸中苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的含量。劉嵐[14]同樣采用HPLC法測定大蜜丸中宋果靈、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量，測得樣品中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿含量為0.011 mg/g、0.173 mg/g、0.001 mg/g，未檢測到樣品中的宋果靈含量。

附子理中丸生物堿測定方法有LC-MS法[9-10]和HPLC法[6、11-18]，其供試品制備方法有氨水-乙醚超聲提取[9-10]、氨水潤濕后乙醚萃取或浸漬提取[11-12]、氨水-乙醚處理后氯仿萃取[13]，但使用氯仿萃取的方法未檢測到苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿，是與供試品有關(guān)還是供試品溶液制備方法有關(guān)，尚需進一步研究確定。

除了對單體生物堿成分進行含量測定，也有對總生物堿進行含量測定。李蘭芳[15]采用改良異羥肟酸鐵法，利用劇毒性雙酯型生物堿脂溶性強，易溶于乙醚、氨醇型水溶性強不溶于醚的特點，建立了雙酯型毒性生物堿的含量測定方法，此方法能夠特異性地測定附子及其制劑中微量的毒性雙酯型總生物堿。烏蘭娜日[16]等采用酸性染料比色法測定總生物堿含量，在水相為pH 6.1±0.1、溴甲酚綠為酸性染料、氯仿為有機溶劑條件下，準(zhǔn)確地測定總生物堿含量。

4.2 甘草苷、甘草酸和甘草次酸含量測定

《中國藥典》2015年版規(guī)定了附子理中丸大蜜丸和水蜜丸中甘草苷以及附子理中片中甘草酸的限量標(biāo)準(zhǔn)[1]。有關(guān)甘草苷含量測定，陳欣[17]測定了濃縮丸中甘草苷含量，測得4個批次樣品中甘草苷含量范圍在0.890～1.700 mg/g。謝亞晶等[18]測定了水蜜丸中甘草苷含量，測得3個批次樣品中的甘草苷含量范圍在0.61～0.63 mg/g。彭飛城[19]等測得25個批次濃縮丸中甘草苷含量范圍在0.42～2.77 mg/g。從研究結(jié)果看，測定的所有樣品中甘草苷含量都符合藥典規(guī)定。

藥典中對片劑規(guī)定了甘草酸含量，文獻對不同劑型的甘草酸含量都有報道。任培培[6]測定大蜜丸和濃縮丸中甘草酸含量的方法，測得7個批次大蜜丸中甘草酸含量范圍在10.22～15.87 mg/丸，3個批次濃縮丸中甘草酸含量范圍在0.87～1.13 mg/丸。孫裕[20]測定濃縮丸中甘草酸含量，測得10個批次樣品中甘草酸含量范圍在2.9657～6.5 237 mg/g。許斐[21]測定水蜜丸中甘草酸含量，測得6個批次樣品中甘草酸含量范圍在1.057～1.165 mg/g。從文獻看，供試品制備所用的提取溶劑、流動相、檢測波長都不盡相同。

此外還對甘草次酸進行了含量測定。任培培[6]建立了通過HPLC法測定附子理中丸大蜜丸和濃縮丸中甘草次酸含量的方法，測得7個不同批次大蜜丸中甘草次酸含量范圍在1.33～1.96 mg/丸，3個不同批次濃縮丸中甘草次酸含量范圍在0.04～0.06 mg/丸。

5 結(jié)語

附子理中丸是臨床廣泛使用的經(jīng)典傳統(tǒng)中藥方，具有多種藥理活性，能應(yīng)用于多種疾病的治療。文獻歸納總結(jié)顯示，在現(xiàn)行版藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，文獻在顯微鑒別、薄層層析鑒別的方法上都有一定提升，從藥典對干姜、黨參、甘草的顯微鑒別和白術(shù)、干姜、甘草的薄層層析鑒別方法，到文獻對處方全部5味中藥的相應(yīng)鑒別方法研究，尤其指紋圖譜用于處方中多成分定性定量分析，從而發(fā)現(xiàn)同一廠家不同批次差異較小，不同廠家差異較大；除了甘草中甘草苷、甘草酸作為藥典含量測定限量成分，君藥制附子中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿，以及總生物堿、佐使藥甘草中甘草次酸，也作為含量測定的成分進行研究。

2015版藥典附子項下，對附子飲片黑順片、白附片等檢查項中，制定了液相色譜法測定雙酯型生物堿烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的含量測定方法，并規(guī)定了3個成分的總量不得過0.010%[1]。在含量測定項下，規(guī)定了6種生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的限量標(biāo)準(zhǔn)。而對于附子理中丸，只是在檢查項下規(guī)定了烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)，體現(xiàn)出復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)低于單味藥標(biāo)準(zhǔn)。臨床有服用附子理中丸毒副反應(yīng)的報道[22-24]，因此提高含有毒性中藥的中成藥質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)十分必要。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:191.

[2] 賈敏如，鄧強.成方制劑中單味藥的顯微特征[J].華西藥學(xué)雜志，1998，13(2):139-140.

[3] 高文蘭，鄭堃.附子理中丸薄層掃描鑒定[J].沈陽藥學(xué)院學(xué)報，1986，3(1):58.

[4] LIU HUI，SU JUAN，YANG XI，et al. A novel approach to characterize chemicai consistency of traditional Chinese medicine Fuzi Lizhong Pills by GC-MS and RRLC-Q-TOFMS[J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2011，9(4):267.

[5] 任培培，孫國祥，孫麗娜.附子理中丸多波長融合HPLC指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2009，29(3):411.

[6] 任培培.附子理中丸HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2008.

[7] 孫國祥，任培培，蔡新鳳，等.附子理中丸方藥配伍HPLC指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2009，7(9):705.

[8] DONG LINYI，CHENG BINFENG，LUO YI，et al. Identification of Nuclear Factor-κB Inhibitors and β2 Adrenergic Receptor Agonists in Chinese Medicinal Preparation Fuzilizhong Pills Using UPLC with Quadrupole Time-of-flight MS [J]. Phytochmical Analysis，2014，25(2): 113

[9] 劉永剛.附子及附子理中丸中烏頭類生物堿的化學(xué)和代謝研究[D].吉林：吉林大學(xué)，2007.

[10] 索志榮，徐敏，秦海燕，等. LC-MS測定附子理中丸中3種雙酯型生物堿含量[J].藥物分析雜志，2010，30(12):2279.

[11] 鐘碧華，陸帥.HPLC法測定附子理中丸中烏頭堿的含量[J].海峽藥學(xué)，2014，26(11):115.

[12] 朱瑞龍,景明,柴國林,等. HPLC測定附子理中丸中雙酯型烏頭堿含量[J].中成藥，1996，18(10):13.

[13] 邵峰，俞瑜，任剛，等.HPLC同時測定附子理中丸中3種單酯型生物堿含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(16):57.

[14] 劉嵐，范智超，張志琪.HPLC同時測定成藥中4種烏頭類生物堿含量[J].藥物分析雜志，2010，30(2):236.

[15] 李蘭芳，趙淑云，藍(lán)慶榮，等.附子及其幾種制劑中劇毒性生物堿的含量測定[J].中成藥研究，1987，9:13.

[16] 烏蘭娜日，王玉華，王偉，等.酸性染料比色法測定附子理中丸中總烏頭生物堿的含量[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1996，13(4):30-31.

[17] 陳欣. HPLC法測定附子理中丸(濃縮丸)中甘草苷的含量[J]. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015,5:30-31.

[18] 謝亞晶，席珊珊. HPLC法測定附子理中丸(水蜜丸)含量[J]. 黑龍江科技信息，2016，14:8.

[19] 彭飛城,丁野,鄭金鳳,等. 附子理中丸(濃縮丸)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立[J]. 中國藥師，2013，2:256-258.

[20] 孫裕，孫巖，楊玉華. HPLC法測定附子理中丸(濃縮丸)中甘草酸的含量[J]. 甘肅中醫(yī)，2010，4:29-31.

[21] 許斐. 高效液相色譜法測定附子理中丸中甘草酸含量的研究[J]. 中國保健營養(yǎng)旬刊，2013，23(5):2636-2637

[22] 張慶輝. 附子理中丸中毒致心律失常1例[J]. 臨床薈萃，2010，25(23):2082.

[23] 陳玉秋. 附子理中丸中毒致嚴(yán)重休克心律失常l例[J]. 吉林醫(yī)學(xué)信息，2002(7):42-42.

[24] 王建凱，劉國良. 附子理中丸致中毒反應(yīng)2例報道[J]. 實用中醫(yī)藥雜志，2001，17 (1):43.

Pesearch Progress on the Quality Standard of Fuzi Lizhong Pill

GAN Jia-he, WANG Chun, SONG Zhi-qian, NING Zhang-chi, MA Xin-ling, LIU Zhen-li△
(TheInstituteofBasicTheoryofChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective：This paper summarizes the literatures on the quality standard of Fuzi Lizhong Pills, and provides reference for improving its quality control standard. Methods：Related literatures on the qualitative identification, fingerprint, inspection and content determination of the Fuzi Lizhong big honeyed pills, water-honeyed pills, water pills and tablets were summarized and reviewed. Results：Prescription of five kinds of traditional Chinese medicine microscopic identification and thin layer chromatography identification methods have been studied. Fingerprints were utilized to quantitatively and quantitatively analyze the multivariate constituents in the prescription, and found that the same manufacturers different batches of small differences, different manufacturers vary greatly. Benzoylmesaconine, benzoylaconitine, benzoylhypaconitine, mesaconitine, aconitine and hypaconitine from processed Fuzi, and liquiritin, glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid from radix glycyrrhizae were used as the content determination of the components of the study. Conclusion：Based on the characteristics of formula of Fuzi Lizhong, we should establish a qualitative identification of fingerprints, multi-component content determination of quality control methods including the main herb of formula processed Fuzi and the main components of other medicine, thus ensuring the safety and efficacy of clinical medication and stable and controllable.

Fuzi lizhong Pill; Qualitative identification; Fingerprint; Content determination

中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所基本科研業(yè)務(wù)費自主選題項目(YZ-1542)-附子理中丸傳統(tǒng)與現(xiàn)代劑型整體成分群與入血成分對比研究

甘嘉荷(1992-)，女，廣西人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評價研究。

△通訊作者：劉振麗，研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評價研究，Tel：010-64089059，E-mail：zhenli_liu@sina.com。

R286

A

1006-3250(2017)08-1183-04

2017-01-17