補腎益氣明目方組方藥物治療視神經萎縮靶向機制初探*

趙子德，張瑩瑩，柏 梅，梁 俊，王軍杰，魏彬彬，王 影△

(1. 中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京 100041； 2. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

視神經萎縮是由他病引起的視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞及其軸突變性，表現(xiàn)為嚴重的視功能受損，尚無有效的治療措施。唐由之教授是我國著名的中醫(yī)眼科學家，在視神經萎縮(optic atrophy, OA)的中藥治療中積累了豐富的臨床經驗，提出“補虛化瘀法”，并圍繞其經驗方補腎益氣明目方(黨參、丹參、川芎、山茱萸、菟絲子、枸杞子、女貞子、生芪、熟地、當歸)加減，臨床收效顯著[1]。

復方多藥物組合及藥物多組分給臨床藥理研究帶來極大挑戰(zhàn)。理清藥物-疾病靶向關系對揭示復雜藥理機制極為必要。“生物活性導向下的化學研究思路”的提出，重視以中藥有效組分配伍的方劑架構新模式[2]，因此借助開放生物數(shù)據(jù)平臺，以中藥組分作用靶點為分析單元的臨床藥理研究，展現(xiàn)了極強的驅動力[3-5]。本研究擬基于該平臺，對唐由之治療視神經萎縮之補腎益氣明目方，通過數(shù)據(jù)挖掘初步探索該方有效組分及分子靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥物有效組分及其靶點篩選

本研究通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http:∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，在草藥名稱“Herb name”中分別輸入各個中藥中文名稱，進入搜索“Search”后，再點擊結果中顯示的所輸入中藥的拉丁名稱，在相關靶點“Related Targets”內容中，便可獲取補腎益氣明目方中10味中藥相關的化合物及各化合物對應的分子靶點，在此基礎上，結合藥物靶點和藥物作用信息數(shù)據(jù)庫Drugbank(http:∥www.drugbank.ca/檢索時間2015-7-18)，從中提取上述各中藥已被驗證的有效組分及其對應的分子靶點信息。

1.2 OA疾病靶標獲取

利用囊括人類遺傳、基因表型及疾病基因圖譜數(shù)據(jù)庫OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man http:∥omim.org/檢索時間2015-11-29)，以“optic atrophy”為檢索詞進行搜索，從顯示結果中便可獲取數(shù)據(jù)庫中收集的OA致病相關分子，將此作為本次研究的疾病靶標。

1.3 藥物-疾病靶向分析

藥物作用被歸類為“中靶”與“脫靶”兩種效應，藥物直接擾動致病分子是靶向治療的主要形式。通過篩選具有直接擾動OA分子靶標的藥物、有效組分及其靶點信息，利用文獻挖掘與信號通路數(shù)據(jù)庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.kegg.jp)進行信號通路信息比對，初步探索其靶向機制。

2 結果

2.1 藥物組分及其靶點

通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺，從中提取補腎益氣明目方中各中藥已被Drugbank數(shù)據(jù)庫驗證的有效組分，得到黨參、熟地、丹參、當歸、川芎、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪被驗證的組分數(shù)目分別為11、5、20、6、14、14、22、19、7、13；上述各藥物有效組分涉及的靶點基因符號(gene symbol)數(shù)目分別為133、48、180、28、138、172、135、285、156、218。

2.2 OA疾病靶標

通過OMIM數(shù)據(jù)庫獲得視神經萎縮疾病相關靶標分子(Gene Symbol)379個。

2.3 藥物-疾病靶向分析

通過將經驗方中各藥物靶點與視神經萎縮靶標進行比對，本研究最終確定上述10味中藥中的有效組分直接擾動視神經萎縮靶標分子數(shù)目分別為1、0、2、0、0、3、2、3、5、3，其中涉及5個有效組分luteolin(木犀草素)、protocatechuic acid(原兒茶酸)、quercetin(槲皮素)、vitamin A(維生素A)和sesamin(芝麻脂素)，5個直接擾動靶標EGFR(Epidermal growth factor receptor)、KIF21 A(Kinesin family member 21 A)、GJA1(Gap junction alpha-1)、ACOX1(Acyl-CoA oxidase 1)、G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)。

3 討論

研究表明，攻擊單個靶標對于復雜疾病幾乎沒有影響[6]，這可能源于系統(tǒng)具有魯棒性，而抑制多個靶標比單一抑制更加有效，因此設計多靶點干預的有效藥物組合極具挑戰(zhàn)。本文針對補腎益氣明目方10味組方藥物的直接作用靶點和OA疾病靶標進行挖掘，OA顯示其多基因復雜疾病特點，所有藥物均呈現(xiàn)多組分多靶點特征，其中黨參、丹參、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪的有效組分能直接干預OA靶標，且藥物中靶顯示出高度集中性。其中，菟絲子所含有效組分(sesamin、quercetin)占有最高“中靶率”，并呈現(xiàn)多角度干預。

3.1 促神經細胞的生成及穩(wěn)態(tài)

結果顯示，黨參、丹參、枸杞子、女貞子、菟絲子、黃芪均可直接直接調控EGFR分子。EGRF是一種絡氨酸激酶受體(RTK)，研究表明EGFR與配體結合促進自噬體與溶酶體的融合，從而維持神經膠質細胞的穩(wěn)定狀態(tài)[7]，防止細胞變性，而在受損區(qū)域星形膠質細胞可以形成不成熟的神經細胞[8]，隨后又發(fā)育為成熟的神經細胞。而在果蠅體內，EGFR與配體Spitz(一種被視為轉移生長因子-α樣配體)結合時能促進神經上皮的增殖和成神經細胞的形成[9]。另外，利用軸突蛋白tau和神經元蛋白β微管蛋白/神經絲評估神經元細胞培養(yǎng)過程中軸突再生程度時發(fā)現(xiàn)，當EGFR過表達時Tau蛋白和β微管蛋白/神經絲被上調，在EGFR被阻斷時后者被下調[10]，同時這種調控模式被發(fā)現(xiàn)存在于EGFR與mTOR和Akt之間，mTOR和Akt則在胎兒鼠和幼鼠的神經元細胞中高度表達，而在老年鼠中低表達，這表明EGFR在mTOR和PI3K / Akt通路激活條件下具有調節(jié)神經元固有再生的重要潛力。

3.2 胞間信號傳導及運輸動力調控

GJA是枸杞子、山萸肉、女貞子、菟絲子、黃芪共同的目標調控分子,是一種間隙連接蛋白，這種蛋白在人類視神經網(wǎng)膜組織中主要表達于神經膠質細胞、血管和上皮細胞，并參與線粒體基質離子流動和呼吸調節(jié)。6個連接蛋白形成一個連接子或質膜半通道，這種通道具有相對非特異性，允許小于1000道爾頓的分子以被動擴散的形式通過，如可以影響細胞發(fā)育命運被稱為形態(tài)發(fā)生素的一組生化分子等。在病理條件下，損傷的細胞可能通過間隙連接影響周圍健康細胞，相反必要的營養(yǎng)物質也可以通過間隙連接供給臨近健康細胞而避免損傷。研究表明,間隙連接蛋白可能牽連著中樞神經系統(tǒng)損傷后神經元死亡的病理[11]。利用基因敲除/敲入技術，連接蛋白被證實對腦組織缺血再灌注損傷具有重要保護作用[12]。在誘導細胞毒性或缺血條件下，間隙蛋白的藥理阻斷還可以終止幾乎所有視網(wǎng)膜無長突細胞的丟失以及降低大部分神經節(jié)細胞的丟失[13]。此外，EGFR和GJA同位于間隙連接通路(Gap junction pathway)的上游位置，且該通路顯示涉及視皮層與視網(wǎng)膜功能、細胞凋亡、鈣離子平衡等調控。間隙連接包含細胞間通道，不同于體內神經、內分泌交互機制，這允許相鄰細胞之間通過細胞質進行短程通訊[14]。間隙連接通訊被認為不論對中樞神經系統(tǒng)還是外周神經系統(tǒng)的髓鞘和軸突生存都至關重要[15]，分別通過介導少突-星形膠質細胞間和雪旺氏細胞間的胞間通訊。在脫髓鞘神經膠質中，間隙連接調控著生理過程，如細胞的生長、增殖、鈣信號傳導以及參與連接蛋白構成的半通道所釋放的神經遞質介導的細胞外信號傳導。因此，針對這類間隙蛋白的干預被認為是新的治療策略，以減少神經病理條件下逐漸損失的細胞。

另外，KIF21 A是正端走向驅動蛋白家族中的一員，在神經元中這一蛋白通過利用ATP水解釋放能量，沿軸突微管運輸必要細胞組分[16]，驅動蛋白活性的嚴格調節(jié)與神經系統(tǒng)發(fā)育及神經系統(tǒng)致病密切相關[17-18]，盡管較多的研究集中在KIF21 A與眼動神經之間的關系。因此，方中藥物針對EGFR、GJA、KIF21 A的調控關系到胞間信號轉導及運輸動力調控等方面，可能涉及神經細胞重要的物質和能量代謝過程。

3.3 抑制退行進程與抗氧化

過氧化物酶體?；o酶A氧化酶是由ACOX1編碼的一種蛋白，ACOX1的缺乏是過氧化物酶體長鏈脂肪酸氧化的一種罕見性疾病，它的缺乏在人類可能引起包括視神經萎縮在內的致命性神經退化過程，即神經元的丟失導致持續(xù)脫髓鞘改變[19]，嚴重的神經系統(tǒng)異常在該基因敲除小鼠模型中同樣可以觀察到[20]。G6PD是一種存在于人體紅細胞內、協(xié)助葡萄糖進行新陳代謝的酵素。研究表明，G6PD的缺乏可以降低缺血性視神經病變的風險[21]，這可能是由于其缺乏而導致NADPH產生不足，降低NADPH依賴的氧化酶衍生的活性氧，保護組織或器官免受氧化損傷[22]。然而G6PD似乎是把雙刃劍，這源于其高表達在缺血再灌注期間又呈現(xiàn)出對抗DNA氧化損傷及防止神經退行性病變等神經保護作用[23]。

綜上可見，唐由之經驗方組方藥物可能通過其有效組分直接命中多個OA靶標，其機制涉及促神經細胞的生成及穩(wěn)態(tài)、胞間信號傳導、胞間運輸動力調控、抑制退行進程、抗氧化等神經再生和神經保護等。組方藥物間存在共享和獨有靶點，預示著可能存在藥物聯(lián)合應用的復雜機制或組方機制。在此，大數(shù)據(jù)分析為深入揭示方證、方病相關性帶來巨大潛力[24]，未來研究將基于網(wǎng)絡藥理學理論框架進一步解析該組方藥物有效組分靶點與OA疾病靶標之間的復雜關系，并進行生物學驗證，揭示其組方機制，指導臨床用藥(致謝：感謝唐由之教授對本研究的支持)

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