豬圓環(huán)病毒2型高滴度培養(yǎng)方法的研究進(jìn)展

張海洋 呂超超 肖 燕 孫進(jìn)忠

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽(yáng) 471003）

豬圓環(huán)病毒2型高滴度培養(yǎng)方法的研究進(jìn)展

張海洋 呂超超 肖 燕 孫進(jìn)忠

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽(yáng) 471003）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）流行廣泛，可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，還與皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病相關(guān)，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。疫苗能有效防治PCV2，減少病毒對(duì)豬群的損害。但PCV2在細(xì)胞的增殖滴度普遍不高，制約著疫苗的品質(zhì)及成本。通過(guò)對(duì)目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上PCV2全病毒滅活疫苗的制備工藝及相關(guān)報(bào)道進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)刺激細(xì)胞或改造和篩選細(xì)胞促進(jìn)PCV2在細(xì)胞上的高效增殖，在PCV2疫苗的制備中具有良好的應(yīng)用前景。

豬圓環(huán)病毒2型 高敏感細(xì)胞 培養(yǎng)

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是直徑為17 nm的無(wú)包膜病毒，包含1.76 kb單鏈環(huán)形DNA基因組。PCV有PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV1于1974年首次從豬腎傳代細(xì)胞系PK15中分離[1]，1982年確定為PCV[2]，即后來(lái)的PCV1；PCV2于1997年從加拿大西部患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的豬群中分離[3]，該病毒與PCV1相似，但具有致病性，后經(jīng)測(cè)序表明其與PCV1在基因結(jié)構(gòu)上存在一定差異，因此命名為PCV2。隨后，各國(guó)陸續(xù)報(bào)道該病，2000年我國(guó)首次報(bào)道用ELISA方法在國(guó)內(nèi)不同年齡段的豬群中檢測(cè)到PCV2抗體[4]。

PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，還與皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病相關(guān)，但臨床上以PMWS最為常見(jiàn)[5-7]。目前，PCV2在我國(guó)已普遍存在，表現(xiàn)為流行范圍廣，陽(yáng)性率高、混合感染嚴(yán)重、種豬感染率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響豬群健康，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，PCV2疫苗的有效使用，對(duì)于該病的防控具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外商品化的PCV2疫苗有多種，一般為全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗。亞單位疫苗是通過(guò)桿狀病毒或者大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap蛋白，在一定條件下形成病毒樣粒子（virus-like particles，VLPs）制備而成，免疫豬只后可以對(duì)PCV2產(chǎn)生較好的免疫力。較全病毒滅活疫苗，亞單位疫苗價(jià)格相對(duì)昂貴，目前市場(chǎng)上使用范圍較廣的多為全病毒滅活疫苗，全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)主要采用豬腎細(xì)胞系PK15培養(yǎng)，但以PK15細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2病毒滴度一般僅為104～105TCID50/ml[8，9]，免疫熒光染色顯示受感染的PK15細(xì)胞中僅有20%對(duì)PCV2易感[10]。這可能是制約PCV2全病毒滅活苗疫苗開(kāi)發(fā)的技術(shù)瓶頸，因此，研究提高PCV2在細(xì)胞內(nèi)增殖滴度的方法成了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，同時(shí)也成了PCV2全病毒滅活苗開(kāi)發(fā)需要克服的最大障礙。參閱相關(guān)報(bào)道，本文將促進(jìn)PCV2在細(xì)胞中高效增殖的兩種途徑，即刺激細(xì)胞促進(jìn)PCV2增殖，以及改造和篩選細(xì)胞促進(jìn)PCV2增殖進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹：

1 通過(guò)刺激細(xì)胞促進(jìn)PCV2增殖

PCV2適于在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂期的細(xì)胞上復(fù)制，并且PCV2的復(fù)制依賴細(xì)胞周期S期表達(dá)的細(xì)胞蛋白。PCV2在原代胎豬腎細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞中不生長(zhǎng)，在傳代PK15細(xì)胞中生長(zhǎng)，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變，通常需要借助PCR、間接免疫熒光或原位核酸雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)。通常在接種PCV2的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物中加入某些孵育劑，以促進(jìn)PCV2復(fù)制。Tischer等在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入300mM的D-氨基葡萄糖發(fā)現(xiàn)，D-氨基葡萄糖促進(jìn)PCV2 DNA進(jìn)入細(xì)胞核中，使得病毒基因組參與有絲分裂S期DNA復(fù)制過(guò)程，從而增加PCV2基因組的復(fù)制效率[10]。Misinzo等用甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）處理可減少細(xì)胞膜膽固醇，PCV2感染內(nèi)皮細(xì)胞是通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴、肌動(dòng)蛋白和Rho-GTPase依賴途徑進(jìn)行的，當(dāng)細(xì)胞膜上膽固醇缺失時(shí)，PCV2的感染量會(huì)有所提高[11]。IL-2可促進(jìn)各類上皮細(xì)胞增殖（由G1期進(jìn)入S期），增加一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞分裂S期宿主細(xì)胞的酶以及病毒中間產(chǎn)物合成次數(shù)，從而可持續(xù)促進(jìn)PCV2的增殖[12]。另外，刀豆蛋白（ConA）、α干擾素、γ干擾素的處理均可促進(jìn)PCV2在PK15細(xì)胞上增殖[12-14]。

2 通過(guò)改造和篩選細(xì)胞促進(jìn)PCV2增殖

細(xì)胞克隆是進(jìn)行病毒學(xué)研究的重要手段，它廣泛應(yīng)用于病毒的分離鑒定、增殖及疫苗生產(chǎn)等方面。Marc-145細(xì)胞即是通過(guò)親本細(xì)胞MA-104細(xì)胞系克隆出的豬繁殖與呼吸綜合征病毒高敏感細(xì)胞系，極大地便利了豬繁殖與呼吸綜合征病毒的增殖培養(yǎng)[15]。

高敏感細(xì)胞系的篩選也是促進(jìn)PCV2在細(xì)胞高效增殖的一個(gè)研究方向。目前，國(guó)外已經(jīng)篩選出這樣的細(xì)胞系PK15-C1，并通過(guò)研究該細(xì)胞系的相關(guān)特性證實(shí)，高敏感細(xì)胞系PK15-C1可促進(jìn)PCV2在細(xì)胞上增殖，對(duì)用于PCV2體外復(fù)制，以及疫苗、診斷相關(guān)研究有著重要的作用[16]。國(guó)內(nèi)從PK15細(xì)胞中篩選出的PK15-B1高敏感細(xì)胞系，通過(guò)該細(xì)胞系的相關(guān)特性研究，也證明了利用高敏感細(xì)胞系可促進(jìn)PCV2的增殖，并且該細(xì)胞系穩(wěn)定性好，IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PK15-B1細(xì)胞感染PCV2的滴度可達(dá)到107TCID50/ml[17]。彭伍平等利用有限稀釋法從現(xiàn)有PK15細(xì)胞系中克隆出一株對(duì)豬圓環(huán)病毒2型具有高敏感性的細(xì)胞克隆株P(guān)KK，初步研究了PCV2在該克隆株上的增殖特性，證明了高敏感細(xì)胞系可以促進(jìn)PCV2在細(xì)胞上增殖，病毒滴度最高可達(dá)107.0TCID50/ml，這一研究結(jié)果將有利于進(jìn)一步研究豬圓環(huán)病毒2型體外復(fù)制、體外診斷及開(kāi)發(fā)高效價(jià)PCV2全病毒滅活疫苗[18]。另外，有學(xué)者已經(jīng)從PK15細(xì)胞系中克隆出PKKC細(xì)胞系，不僅可以促進(jìn)PCV2在細(xì)胞上增殖，病毒滴度可達(dá)106.8TCID50/ml，而且會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞病變，更為直觀判斷病毒滴度，有利于豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)、疫苗開(kāi)發(fā)及體外診斷的研究[19]。

陳福旺選用能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的IL-2作為目的基因構(gòu)建IL-2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，研究表明，無(wú)論用高滴度病毒或低滴度病毒接種，PK15-IL-2增加PCV2復(fù)制量和滴度均高于對(duì)照細(xì)胞5-10倍，連續(xù)攻毒后，PCV2拷貝數(shù)可到1×1010/ml，病毒TCID50為109.0-109.5/ml，證明了通過(guò)改造高敏感細(xì)胞系也可以促進(jìn)PCV2在細(xì)胞上增殖，有利于豬圓環(huán)病毒2型致病機(jī)理研究、病毒培養(yǎng)、全病毒滅活疫苗開(kāi)發(fā)以及工業(yè)化生產(chǎn)[20]。

3 總結(jié)

PCV2在PK15細(xì)胞系上增殖病毒滴度不高，難以達(dá)到制備全病毒滅活疫苗的要求，一直以來(lái)是制約PCV2全病毒滅活疫苗的技術(shù)瓶頸。通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加D-氨基葡萄糖、甲基-β-環(huán)糊精、刀豆蛋白、IL-2等，改造或篩選高敏感細(xì)胞系均可持續(xù)促進(jìn)PCV2在細(xì)胞中復(fù)制增殖，提高PCV2的滴度，降低PCV2全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)成本及產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而提高企業(yè)的生產(chǎn)效益和競(jìng)爭(zhēng)力。

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∶“公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303046）”

∶張海洋（1983-），男，本科生。

∶孫進(jìn)忠，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸用生物制品工程技術(shù)的研究。