豬偽狂犬病PCR與ELISA檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王艷斌，趙禮軍，申艷瑋

（1.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源 459000；2.山東德州市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)分所，山東德州 253000）

豬偽狂犬病PCR與ELISA檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王艷斌1，趙禮軍1，申艷瑋2

（1.河南省濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南濟(jì)源 459000；2.山東德州市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督所經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)分所，山東德州 253000）

豬偽狂犬?。≒R）在全球廣泛流行，給豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。如何實(shí)現(xiàn)對(duì)該病快速、準(zhǔn)確、方便、價(jià)廉地的診斷具有重要意義。PCR和 ELISA具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于一線獸醫(yī)隊(duì)伍快速檢測(cè)PR。本文就PCR和ELISA技術(shù)在豬偽狂犬病診斷方面的最新研究情況進(jìn)行了綜述，以期為PR的快檢快篩檢測(cè)提供參考。

豬偽狂犬病；檢測(cè)；PCR；ELISA

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）又稱奧葉基氏?。ˋujeszky's disease，AD）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）造成的，以發(fā)熱和腦脊髓炎為主要特征的急性接觸性傳染病。豬是PRV主要宿主，隱性感染豬可長(zhǎng)期帶毒并排毒，是該病的主要傳染源，是造成PRV在豬場(chǎng)中難以根除并長(zhǎng)期流行的主要原因。各個(gè)年齡階段的豬均可感染PRV。幼齡哺乳仔豬發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%；成年豬感染無(wú)明顯臨床癥狀或呈隱性感染；妊娠母豬感染后發(fā)生流產(chǎn)和產(chǎn)死胎、木乃伊胎，種豬感染導(dǎo)致不育。PRV只有一個(gè)血清型。目前廣泛采用gE基因缺失株作為疫苗毒株[1]。1947年我國(guó)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)了該病，20世紀(jì)60～70年代出現(xiàn)強(qiáng)毒株并在全球散播，20世紀(jì)80年代該病在我國(guó)呈暴發(fā)式流行。該病呈全球流行性，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失，目前該病仍在全國(guó)流行并出現(xiàn)了變異強(qiáng)毒株[2]。如何快速準(zhǔn)確的檢測(cè)PRV以及隔離淘汰病豬，對(duì)PR的防控、治療與撲滅具有重要的意義。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于快速檢測(cè)PRV，現(xiàn)就PCR和ELISA技術(shù)在PR診斷中的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 PCR在PR檢測(cè)方面應(yīng)用進(jìn)展

目前有多種檢測(cè)PRV的PCR試劑盒上市。最新開(kāi)發(fā)的PCR檢測(cè)方法多為多重RCR，可同時(shí)完成對(duì)多種常見(jiàn)豬病病原的檢測(cè)，有效增加了檢測(cè)范圍并提高了檢測(cè)效率。

2013年Ma等[3]設(shè)計(jì)了可以區(qū)別野生型PRV與疫苗毒株的nanoPCR。該方法通過(guò)檢測(cè)gB蛋白保守序列，來(lái)判定樣品中是否含有PRV；通過(guò)檢測(cè)是否含有疫苗毒株缺失的gE蛋白序列，來(lái)判定樣品是否感染野生型PRV，并使用該方法檢測(cè)110份接種過(guò)PRV疫苗的豬樣品發(fā)現(xiàn)仍然有53%的樣品感染野生型毒株。2015年Luo等[4]研發(fā)了可同時(shí)檢測(cè)PRV和豬博卡病毒（PBoV）的nanoPCR。該方法使用了兩對(duì)特異引物，可擴(kuò)增出316 bp的PRV保守序列和996 bp 的PBoV保守序列，最低可檢測(cè)到6個(gè)PRV保守序列的重組質(zhì)?；?5個(gè)PBoV保守序列的重組質(zhì)粒，靈敏度較普通PCR分別提高了100倍和1000倍。使用該方法檢測(cè)550份臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果與商品化PCR試劑盒相同。2015年Hu等[5]設(shè)計(jì)研發(fā)了可同時(shí)檢測(cè)豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、PR和豬藍(lán)耳病病毒的普通PCR，該方法使用了5對(duì)特異性引物，在同一個(gè)反應(yīng)中，其最低檢測(cè)限分別為為1.09×104、1.50×103、 2.10×103、1.30×103和 8.97×102個(gè)重組DNA質(zhì)粒，使用該方法檢測(cè)46份臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果相同。

在應(yīng)用qPCR檢測(cè)PRV方面。2010年Song等[6]開(kāi)發(fā)了能夠檢最低檢測(cè)到1 × 102含目的蛋白重組質(zhì)粒，的Taqman熒光探針qPCR方法，使用該方法和普通PCR平行檢測(cè)41份臨床樣品，檢測(cè)到32份呈陽(yáng)性，普通PCR檢測(cè)到11份呈陽(yáng)性，檢測(cè)靈敏度較普通PCR大幅提高，顯示了更好的應(yīng)用前景。2012年P(guān)érez 等[7]設(shè)計(jì)了可以同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、PRV和Torque teno sus virus 1 型和2 型病毒的qPCR方法，該方法同時(shí)可以檢測(cè)到3.65×103到 5.04×103個(gè)含病毒目的 DNA的重組質(zhì)粒。通過(guò)樣品檢測(cè)證明該方法的檢測(cè)結(jié)果與每種病毒的PCR檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致。2014年Wu[8]建立了可同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病毒、PRV、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、和乙型腦炎病毒等6種病毒的TaqMan探針qPCR方法，該方法最低能檢測(cè)到每毫升含有10 個(gè)豬圓環(huán)病毒、PRV、豬瘟病毒目的 DNA重組質(zhì)粒，使用該方法檢測(cè)118份臨床樣品，與檢測(cè)單個(gè)病毒的PCR方法檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)99.2%。

在應(yīng)用新PCR及相關(guān)技術(shù)檢測(cè)PRV方面。2015年Chen 等[9]運(yùn)用Luminex公司基于PCR和磁珠技術(shù)開(kāi)發(fā)的xMAP技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了可同時(shí)檢測(cè)PRV、豬藍(lán)耳病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒和豬細(xì)小病毒的方法。該方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA病毒和DNA病毒的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，且檢測(cè)速度快，在2h內(nèi)便可完成檢測(cè)。通過(guò)檢驗(yàn)臨床樣品證實(shí)，該方法的靈敏度高于普通PCR，與qPCR相同。2015年Zhang 等[10]開(kāi)發(fā)了可以同時(shí)檢測(cè)豬藍(lán)耳病病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬流感病毒（H1和H3亞型）、豬圓環(huán)病毒、PRV和乙型腦炎病毒，共計(jì)9種病毒的GeXP（Genome Lab Gene Expression Prof i ler）方法。該方法使用了9對(duì)檢測(cè)引物，引物由5'端通用檢測(cè)引物和與之相連的擴(kuò)增單個(gè)病毒目的DNA片段引物構(gòu)成，該方法檢測(cè)單種病毒時(shí)，最低檢測(cè)到含病毒目的DNA的重組質(zhì)粒濃度分別為1000 個(gè)/μL 含PRV的重組質(zhì)粒，100個(gè)/μL含豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒和乙型腦炎病毒目的基因的重組質(zhì)粒，10 個(gè)/μL含豬流感病毒（H1和H3亞型）和豬藍(lán)耳病病毒目的基因的重組質(zhì)粒。使用該方法檢測(cè)114 份臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果與使用單種病毒qCPR或RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相符合，并且具有相同的檢測(cè)敏感性和特異性。

此外，很多文獻(xiàn)對(duì)檢測(cè)PRV的PCR方法進(jìn)行了系統(tǒng)、科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦u(píng)判，有效證明了在檢測(cè)PRV方面，PCR具有良好的特異性和靈敏性，可大規(guī)模推廣應(yīng)用。2012年 Zanella等[11]使用病毒分離法和qPCR同時(shí)檢測(cè)1027份臨床鼻拭子，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:與病毒分離方法相比，檢測(cè) gB蛋白編碼DNA的qPCR靈敏度為94.6%，特異度為71.0% ；檢測(cè) gE蛋白編碼DNA的qPCR靈敏度為94.6%，特異度為 79.3%，證明了qPCR是一種方便快捷有效的PRV檢測(cè)方法。2013年，Pol等[12]使用Adiagène公司開(kāi)發(fā)的商品化ADIAVET qPCR試劑盒檢測(cè)多種臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果與病毒分離方法一致，證明了該方法具有良好的檢測(cè)特異性和靈敏性，適用于臨床樣品的快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)。

2 ELISA在PR檢測(cè)方面應(yīng)用進(jìn)展

目前商品化ELISA試劑盒多通過(guò)檢測(cè)gE蛋白或相關(guān)抗體，以區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬，通過(guò)檢測(cè)gB蛋白抗體評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。牛春玲等[13]統(tǒng)計(jì)了2004年之前ELISA在PR檢測(cè)方面應(yīng)用，系統(tǒng)介紹了直接ELISA、間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA）、SPA-ELISA、雙抗體夾心ELISA、單抗夾心ELISA等多種方法在PRV或其抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。目前對(duì)利用ELISA方法檢測(cè)PR的研究仍在繼續(xù)，主要集中于表達(dá)具有良好生物活性的PRV蛋白或肽段，來(lái)開(kāi)發(fā)成本更低、特異性更高的ELISA試劑盒。在生產(chǎn)方面對(duì)提高ELISA試劑盒的穩(wěn)定性、可重復(fù)性不良和減少假陽(yáng)性的工作一直在進(jìn)行中。

2003年Ao等[14]使用畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白，制備了可以區(qū)分疫苗毒株免疫豬和野毒株感染豬的間接ELISA試劑盒，該試劑盒使用重組蛋白包被ELISA板以檢測(cè)血清中的抗原，將 gE基因151～714位DNA序列克隆到畢赤酵母菌表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒中，獲得了目的蛋白質(zhì)，隨后使用該蛋白包被ELISA板。使用該方法和IDEXX公司同類試劑盒檢測(cè)了348份臨床樣品，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩者的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。2004年倪健強(qiáng)等[15]采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了gE蛋白抗原反應(yīng)區(qū)，并且不含信號(hào)肽、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的主要抗原表位區(qū)，獲得了大小約為63 kD的重組可溶性蛋白，將其純化為ELISA抗原，制備了具有良好特異性和敏感性的PRV ELISA鑒別診斷方法。使用該方法檢測(cè)400份送檢血清樣品，結(jié)果分析表明，其檢測(cè)結(jié)果與PRV全病毒制備的ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果符合率95%以上，與基于抗gE 蛋白單抗競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為94%，表明此方法可用于區(qū)分PRV疫苗免疫豬和PRV野毒感染豬。2008年Gómez等[16]使用桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白制備了可以區(qū)分疫苗毒株免疫豬和野毒株感染豬的間接ELISA試劑盒，其具有成本低，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。其桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了經(jīng)剪輯的PRV gE 基因，與野生型gE蛋白質(zhì)相比，該重組蛋白去除了信號(hào)肽和跨膜域。使用該方法檢測(cè)101份已知血清樣品，檢測(cè)結(jié)果與INGENASE和IDEXX公司ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。2011年Serena 等[17]使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了包含藍(lán)舌病NS1蛋白和PRV gE蛋白主要抗原肽段的重組蛋白，其中藍(lán)舌病NS1蛋白能自我折疊形成具有良好免疫源性的螺旋結(jié)構(gòu)并有助于重組蛋白純化，PRV gE蛋白主要抗原肽段與 NS1蛋白C端連接并在排列于NS1蛋白螺旋結(jié)構(gòu)表面形成了完整的空間構(gòu)象并具有良好的生物學(xué)活性，使用該重組蛋白做為抗原包被ELISA板，成功制備了區(qū)分疫苗毒株免疫豬和野毒株感染豬的間接ELISA試劑盒。

3 小結(jié)

目前多種疾病在豬群中流行，多以混合感染為主，給豬病的檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。疫苗廣泛的用于疾病的預(yù)防與控制，對(duì)用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法診斷豬病造成了嚴(yán)重干擾。PR給我國(guó)的豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失，PRV基因缺失疫苗被廣泛應(yīng)用于該病的預(yù)防，快速準(zhǔn)確檢測(cè)PR對(duì)該病的預(yù)防、治療、控制和消滅具有重要的意義。與病毒分離、中和實(shí)驗(yàn)等方法相比，PCR和ELISA技術(shù)具有成本低、簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，更適合PR快速檢測(cè)和基層檢測(cè)。隨著技術(shù)的發(fā)展，PCR和ELISA檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度都得到了提高，還在向朝著降低生產(chǎn)和檢測(cè)成本的方向發(fā)展，且PCR還實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種疾病的同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)不斷改進(jìn)與完善，PCR和ELISA在PR及豬病檢測(cè)方面將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

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（責(zé)任編輯：孫榮釗）

Advances in PCR and ELISA Methods for the Detection of Porcine Pseudorabies

Wang Yanbin1，Zhao Lijun1，Shen Yanwei2
（1. Jiyuan Animal Health Supervision Institution，Jiyuan，Henan 459000；2. Economic And Technological Development Zone Branch Off i ce of Dezhou City Animal Products Quality and Safety Supervision Station，Dezhou，Shandong 253000）

Porcine pseudorabies （PR） is distributed world wide and causes great harms for pig farming industry. The fast，accurate，convenient and inexpensive diagnosis of the disease is of great signif i cance. PCR and ELISA methods have the advantages of simple operation，high sensitivity，simple result determination and low cost. They are widely used for the detection of PR in the fi eld. In this paper，the latest research for diagnosing porcine pseudorabies with PCR and ELISA methods were summarized，so as to provide reference in terms of quickly detection for PR.

porcine pseudorabies（PR）；detection；PCR；ELISA

S851.33

：A

：1005-944X（2017）06-0074-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.022