孕激素對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖、凋亡的影響

尤俊嶺

（遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001）

孕激素對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖、凋亡的影響

尤俊嶺

（遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 錦州 121001）

目的探討孕激素對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對體外增殖及凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀觀察不同濃度孕酮對細(xì)胞周期及凋亡率的影響、光學(xué)顯微鏡檢測其形態(tài)學(xué)變化、MTT比色法觀察不同濃度孕酮對細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果流式細(xì)胞儀分析，實驗組G0/G1期上升，S期下降，細(xì)胞凋亡率上升；光鏡可觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；MTT結(jié)果顯示，隨著孕酮濃度的增加，其對細(xì)胞生長的抑制作用明顯增強(qiáng)，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性。結(jié)論孕酮抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

子宮內(nèi)膜癌；孕酮；增殖；凋亡

近年來，子宮內(nèi)膜癌的孕激素治療已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注和研究，臨床應(yīng)用也取得了較大進(jìn)展。本研究采用MTT、FCM及形態(tài)學(xué)檢測手段觀察了不同濃度的孕激素在體外對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，從而為臨床治療內(nèi)膜癌可否進(jìn)行激素替代治療提供了理論依據(jù)，進(jìn)而證實孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的療效性和進(jìn)一步探索的遠(yuǎn)大前景。

1 材料與方法

1.1 材料：孕酮、DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清、胰蛋白酶、MTT（四甲基偶氮唑鹽）購自北京華美生物技術(shù)有限公司，Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物中心研究室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B細(xì)胞于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度條件下，在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。共分5組，對照組：不加孕激素；治療組根據(jù)所加濃度的不同分為：10-5mol/L組、10-6mol/L組、10-7mol/L組及10-8mol/L組。

1.2.2 細(xì)胞周期與凋亡率的檢測：將細(xì)胞濃度為1×105個/mL的子宮內(nèi)膜癌單細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中（每孔1 mL），每孔加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，過夜貼壁后，4 ℃培養(yǎng)1 h，以促進(jìn)細(xì)胞同步化生長；換培養(yǎng)液，實驗組分別加入含孕酮10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，對照組加等體積的純培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，應(yīng)用Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒（參照說明書的步驟），置流式細(xì)胞儀（FCM）分析。

1.2.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察：24孔培養(yǎng)板底內(nèi)放置消毒過的玻璃蓋片，每孔加入1 mL的濃度為1×105/mL的子宮內(nèi)膜癌單細(xì)胞懸液，于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，實驗組和對照組處理同1、2、2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別做AO染色和TUNEL染色。①AO染色：取出蓋片，溫Hanks液漂洗3～5 s；95%酒精固定15～30 min；1%冰醋酸作用30 s；1×10-4吖啶橙染色30 s～1 min；0.1 mol/L CaCl2處理30 s～2 min；PBS漂洗3次，封片。鏡下觀察并攝影。②TUNEL染色（按試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行操作）：取出蓋片，3.7%中性甲醛液室溫固定10 min；cytonin15 min，3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶5 min；TDT標(biāo)記反應(yīng)液37 ℃，1 h；抗-Brdu 37 ℃，1 h；Streptavidin-HRP 10 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。鏡下觀察并攝影。

1.2.4 細(xì)胞增殖實驗：取對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，制成濃度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，過夜貼壁后，4 ℃培養(yǎng)1 h，以促進(jìn)細(xì)胞同步化生長；換培養(yǎng)液，實驗組分別加入10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，對照組加純培養(yǎng)液。每一濃度均設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后吸凈上清夜，每孔加入二甲亞砜200 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)記光度儀在波長為492 nm時測定每孔的吸光度（A）值，計算不同濃度孕酮對細(xì)胞生長的抑制率[抑制率=（對照組A均值-實驗組A均值）/對照組A均值]。本實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 孕酮對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響：經(jīng)FCM分析，不同濃度孕酮作用腫瘤細(xì)胞72 h后，與對照組相比，細(xì)胞周期分布、凋亡率均發(fā)生改變，即G0/G1期細(xì)胞比例數(shù)上升，S期和G2/M期下降，細(xì)胞凋亡率上升，均有顯著差異，且與孕酮濃度之間具有劑量依賴性，即呈顯著正相關(guān)。

2.2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化：①AO染色：凋亡細(xì)胞體積明顯縮小，核碎裂，核內(nèi)可見濃縮邊集的染色質(zhì)，呈新月形或腎形致密濃染的黃綠色染色，熒光亢進(jìn)。②TUNEL染色：細(xì)胞核經(jīng)蘇木素復(fù)染呈淺藍(lán)色，核相對較大，形態(tài)較為一致。凋亡細(xì)胞斷裂的DNA片段末端經(jīng)標(biāo)記后顯色，核呈棕色或棕褐色，表現(xiàn)為固縮、邊集、碎裂，可見凋亡小體形成。

2.3 孕酮對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響：MTT結(jié)果顯示，隨著孕酮濃度的增加，其對細(xì)胞生長的抑制作用明顯增強(qiáng)，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性，抑制率與孕酮的濃度之間呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 孕酮對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響：本研究選用的是高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，且為PR陽性，提示子宮內(nèi)膜癌是性甾體激素依賴性腫瘤。Ishiwaia等在研究孕激素對人類內(nèi)膜癌細(xì)胞系生長和分化作用時發(fā)現(xiàn)體外孕激素可抑制癌細(xì)胞的生長。本實驗MTT結(jié)果證實，隨著孕酮濃度的增加，其對細(xì)胞生長的抑制作用明顯增強(qiáng)，與對照組比較，差異有顯著性，且具有劑量依賴性。

3.2 孕酮對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響：細(xì)胞凋亡的發(fā)生往往是細(xì)胞先被阻滯在細(xì)胞周期的某一時相，然后發(fā)生凋亡[1]。在一些體外實驗中，也已經(jīng)證實可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡清除某些腫瘤細(xì)胞，而認(rèn)為孕激素促進(jìn)凋亡可能是依賴PR機(jī)制影響了抗凋亡基因蛋白的表達(dá)。本實驗用FCM法觀察了不同濃度孕酮對內(nèi)膜癌細(xì)胞周期分布及凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)孕酮改變了細(xì)胞周期的分布，使細(xì)胞周期出現(xiàn)向G0/G1期移行的特征性動力學(xué)改變，即G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期減少，并可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。當(dāng)孕酮濃度在10-5 mol/L時，細(xì)胞周期分布顯示G0/G1峰前出現(xiàn)一個小于二倍體DNA含量的亞二倍體峰，即細(xì)胞凋亡峰。因此，我們可以推斷孕酮是通過在G0/G1→S間阻斷內(nèi)膜癌細(xì)胞周期的進(jìn)程，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。同時我們在光鏡下也觀測到了癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)上的典型特征。

3.3 孕激素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用機(jī)制：孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的歷史已有40多年，至今機(jī)制不明。一般認(rèn)為孕激素對癌細(xì)胞有直接抑制作用，在外源性孕激素作用下，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分化趨向成熟，分泌活躍，細(xì)胞發(fā)生凋亡和萎縮[2]。目前，對于孕激素治療子宮內(nèi)膜癌作用機(jī)制的研究主要涉及以下幾個方面：①基因水平：有研究[3]發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌孕激素治療過程中，bcl-2基因表達(dá)均發(fā)生降調(diào)節(jié)，并伴隨著腫瘤細(xì)胞分化逐漸成熟，從而認(rèn)為bcl-2可作為子宮內(nèi)膜癌孕激素治療效果的一個標(biāo)記。②細(xì)胞因子：實驗顯示孕激素可直接作用于內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的基因轉(zhuǎn)錄，消除雌激素對內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達(dá)的抑制作用，同時抑制內(nèi)膜細(xì)胞的血管生成多肽mRNA表達(dá)[4]。還可減少子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞表面的硫酸酯，從而減少細(xì)胞與層粘連蛋白結(jié)合，降低腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移能力。③性激素結(jié)合球蛋白和酶：孕激素可通過影響性激素結(jié)合球蛋白對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生作用。也有文獻(xiàn)報道，谷光甘肽過氧化物酶，雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶，17B-羥甾脫氫酶芳香硫基轉(zhuǎn)移酶等可能在孕激素對子宮內(nèi)膜癌的治療中發(fā)揮作用。④細(xì)胞增生與分化：許多研究指出，孕激素治療可減低子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞增生，促使其分化，從而發(fā)揮治療作用。Saegusa[5]等發(fā)現(xiàn)，孕激素治療并不影響腫瘤細(xì)胞凋亡，而是通過促使細(xì)胞分化來抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增生，使組織動力學(xué)向癌細(xì)胞缺失的方向移動。

本實驗通過孕酮對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用結(jié)果，提示了合理劑量的孕酮的應(yīng)用對內(nèi)膜癌患者的激素替代治療有極大的益處，也希望本實驗?zāi)転閷で竽[瘤治療的新方法提供一定的實驗依據(jù)。（如將孕激素與細(xì)胞周期阻滯藥等抗癌藥物耦聯(lián)成生物制劑，既能阻斷癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，抑制腫瘤浸潤性生長，又可以將之阻滯于某一細(xì)胞周期，抑制其增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療癌癥的目的。）

[1] 曾益新.腫瘤學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999.

[2] 陳晨,華祖穆,金曉龍,等.孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的形態(tài)學(xué)觀察與治療機(jī)制探討[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1997,32(7):415.

[3] Saegusa M,Okayasu I.Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinoma[J].J Pathol,1997,182(4):429-436.

[4] Zhang L,Rees MC,Bicknell R.The isolation and long term culture of normal human endometrial epitbelium and stroma,expression of m-RNAfor angiogenic polypeptides basslly and on oestrogen and progesterone challenges[J].J Cell Sci,1995,108(2):323.

[5] Saegusa M,Okayasu I.Progesterone therapy for endometrial carcinomas reduces cell proliferation but alter apoptosis[J].Cancer,1998, 83(1):111-121.

R737.33

B

1671-8194（2017）19-0053-02