人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究

陳頡 馮曉紅 黃琦

人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究

陳頡 馮曉紅 黃琦

目的觀察人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），分為對(duì)照組、波動(dòng)性高糖模型組及人參皂苷低中高濃度組（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL）。Western blot檢測(cè)NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的核轉(zhuǎn)位及下游抗氧化蛋白血紅素加氧酶-1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和醌氧化還原酶（NQO1）的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)下游抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA表達(dá)；Western blot檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA質(zhì)粒后Nrf2總蛋白和核蛋白及下游HO-1、γ-GCS和NQO1蛋白的表達(dá)。結(jié)果人參皂苷治療后，HUVECs中的Nrf2核蛋白及下游抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA質(zhì)粒后，人參皂苷的治療作用消失。結(jié)論人參皂苷通過促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮其抗波動(dòng)性高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的氧化應(yīng)激損傷作用。

波動(dòng)性高糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；Nrf2/ARE；氧化應(yīng)激；人參皂苷

波動(dòng)性高糖較易出現(xiàn)于糖尿病患者的病程中，其較持續(xù)性高糖對(duì)血管內(nèi)皮功能的損害可能更嚴(yán)重[1-3]。波動(dòng)性高糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未清楚闡明，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為發(fā)揮了主要作用。Nrf2/ ARE通路是主要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[4]，通過啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活下游抗氧化蛋白而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用[5]。最近研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病的大血管及微血管并發(fā)癥中，激活Nrf2/ARE通路，可以發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用。我們認(rèn)為Nrf2/ARE通路同樣參與了抗波動(dòng)性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的氧化應(yīng)激過程。我們前期研究證實(shí)了人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖所致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[8]。那么人參皂苷的這種細(xì)胞保護(hù)作用是否與Nrf2/ARE通路有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)擬通過人參皂苷干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），觀察NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的核轉(zhuǎn)位及下游抗氧化蛋白血紅素加氧酶-1（HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和醌氧化還原酶（NQO1）的表達(dá)，探討人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑人參皂苷由浙江省中醫(yī)院提供（批號(hào)：20130819）；DMEM低糖、高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司）；HO-1、γ-GCS和NQO1引物（Takara公司）；兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗HO-1多克隆抗體、兔抗γ-GCS多克隆抗體、兔抗NQO1多克隆抗體（CST公司）；胞漿胞核蛋白抽提試劑盒（碧云天公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購(gòu)于上海生科院細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞培養(yǎng)液含10%胎牛血清，100μ/mL青霉素和100μ/mL鏈霉素液的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%左右，用1mL含EDTA的胰酶消化傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為五組：對(duì)照組（恒定加入5.5mmol/L葡萄糖）、波動(dòng)性高糖組（每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、波動(dòng)性高糖＋三種不同濃度的人參皂苷（12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/ mL）干預(yù)組。各組每24h換液1次，共培養(yǎng)6天后終止培養(yǎng)。

1.4 Western blot檢測(cè)Nrf2的核轉(zhuǎn)位及HO-1、γ-GCS和NQO1的蛋白表達(dá)用PBS輕輕漂洗培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，然后加入RIPA裂解液，冰浴30min，4℃、12 000r、20min離心，取上清為細(xì)胞總蛋白；嚴(yán)格按照核蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，總蛋白上量樣為100μg，核蛋白上樣量60μg，10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（1:200）4℃孵育過夜，加入相應(yīng)的二抗（1:1000），漂洗，加ECL試劑發(fā)光顯影。

1.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA表達(dá)用Trizol試劑提取總RNA，按說明書操作。每份樣品中取1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后取1μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HO-1上游引物：GGAACTTTCAGAAGGGCCAGGT，下游引物：TGCAGCTCTTCTGGGAAGTAGACA，產(chǎn)物片段148bp；γ-GCS上游引物：TGTAGTGCGAGGAAGAG GTATGA，下游引物：GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG，產(chǎn)物片段162bp；NQO1上游引物：AGGACCCTTCCG GAGTAAGAA，下游引物：GTCAGGGAGCCTGGAAAGA，產(chǎn)物片段488bp。GAPDH上游引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物：TGGTGAAGACGCCA GTGGA，產(chǎn)物片段138bp。反應(yīng)在60μL體系中進(jìn)行。擴(kuò)增條件：37℃變性15min，85℃退火5s，4℃延伸10min。，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，于每個(gè)循環(huán)的延伸階段收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)入分析界面，以GAPDH作為內(nèi)參照，根據(jù)每個(gè)樣本擴(kuò)增曲線的Ct值計(jì)算各目的基因表達(dá)水平的相對(duì)定量值，對(duì)照組設(shè)置為1，最終結(jié)果計(jì)為與對(duì)照組進(jìn)行比較后的相對(duì)定量值RQ用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Nrf2質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine2000說明書進(jìn)行，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后，將細(xì)胞分成四組：模型+siRNA對(duì)照組（轉(zhuǎn)染Control siRNA+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+siRNA+人參皂苷組（轉(zhuǎn)染Control siRNA+人參皂苷25μg/mL+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2 siRNA組（轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2 siRNA+人參皂苷組（轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA+人參皂苷25μg/mL+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖），分別刺激48h，收取細(xì)胞。Western blot檢測(cè)HO-1、γ-GCS和NQO1蛋白、Nrf2總蛋白和核蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)以（） 表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1、γ-GCS和NQO1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，各組Nrf2總蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），波動(dòng)性高糖下Nrf2核蛋白表達(dá)明顯增高，人參皂苷治療后進(jìn)一步增強(qiáng)了Nrf2的核蛋白表達(dá)。模型組HO-1、γ-GCS和NQO1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，人參皂苷治療后其蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加（圖1，插頁(yè)）。

2.2 人參皂苷對(duì)HO-1、γ-GCS和NQO1 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，模型組HO-1、γ-GCS和NQO1 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），人參皂苷治療后mRNA表達(dá)進(jìn)一步增加，高濃度組明顯優(yōu)于模型組（P＜0.05）（圖2～3，插頁(yè)）。

2.3 人參皂苷及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA對(duì)各蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在空siRNA組經(jīng)過人參皂苷干預(yù)后Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)提升，而在Nrf2siRNA組及經(jīng)過人參皂苷干預(yù)組，Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)均明顯較前降低（見圖4，插頁(yè)）。

3 討論

糖尿病患者由于自身調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂，易出現(xiàn)血糖的波動(dòng)，研究也已證實(shí)波動(dòng)性高糖較持續(xù)性高糖對(duì)血管內(nèi)皮功能的損害可能更嚴(yán)重[1-3]。波動(dòng)性高糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未清楚闡明，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為發(fā)揮了主要作用。我們前期研究亦表明[8]，波動(dòng)性高糖產(chǎn)生的氧化應(yīng)激使得內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，人參皂苷通過增加細(xì)胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量，明顯抑制波動(dòng)性高糖所致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而對(duì)波動(dòng)性高糖所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。

生理狀態(tài)下，機(jī)體的氧化與抗氧化系統(tǒng)相互拮抗平衡。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)，可以通過多種途徑介導(dǎo)活性氧（ROS）產(chǎn)生增加，使得抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激損傷隨之發(fā)生[9]。Nrf2/ARE通路是主要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[4]。在生理狀態(tài)下，Nrf2與伴侶分子Keap1（kelch-like ECH-associated protein 1）在胞漿中相互結(jié)合后，通過蛋白酶體泛素化途徑降解使得其活性受到抑制；當(dāng)受到來源于ROS信號(hào)攻擊后，Nrf2與Keap1解離并進(jìn)入胞核，與其它bZIP蛋白結(jié)合成異二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件ARE，使ARE相關(guān)抗氧化酶如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、和醌氧化還原酶（NQO1）表達(dá)增加[5]，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用。最近在糖尿病的大血管及微血管并發(fā)癥中的研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/ARE通路，可以發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用[6-7]。

人參為五加科人參屬植物，其作為補(bǔ)虛第一要藥，治療“消渴”早有記載。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，人參具有大補(bǔ)元?dú)?、生津止渴、扶正固本等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)人參皂苷在防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有確切的臨床療效[10-13]，人參皂苷還具有較強(qiáng)的抗氧化和自由基清除能力[14-15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，給予人參皂苷干預(yù)治療后，促進(jìn)了Nrf2的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而增加了HO-1、γ-GCS和NQO1表達(dá)，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Nrf2siRNA后，人參皂苷的治療作用消失，提示人參皂苷對(duì)波動(dòng)性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抗氧化應(yīng)激損傷與其促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，波動(dòng)性高糖產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷使得內(nèi)皮細(xì)胞損傷，人參皂苷保護(hù)波動(dòng)性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制可能是通過激活Nrf2/ ARE信號(hào)通路，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的表達(dá)。

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（收稿：2017-03-02修回：2017-03-20）

Protection of Ginseng on Apoptosis of Endothelial Cells Exposed to Intermittent High Glucose and Its Mechanism

CHEN Jie,FENG Xiaohong,HUANG Qi.Department of Endocrinology,Zhejiang Hospital of TCM, Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of ginseng on apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）exposed to intermittent high glucose and the underlying mechanism.Methods HUVECs were cultured and divided into 5 groups:control group,intermittent high glucose group,and low（12.5μg/mL）,middle（25μg/mL）, high（50μg/mL）dosage of ginseng treatment group.The nucleoprotein of Nrf2 and its downstream antioxidant enzymes such as heme oxygenase-1（HO-1）,γ-glutamyl cysteine synthetase（γ-GCS）and NAD（P）H quinone dehydrogenase 1（NQO1）were detected by Western blot.The mRNA level of HO-1,γ-GCS and NQO1 were detected by RTPCR.Western blot was used to detect the nucleoprotein of Nrf2,and HO-1,γ-GCS and NQO1 after HUVECs transfected with Nrf2 siRNA.Results After the treatment of ginseng,the nucleoprotein of Nrf2 and the level of mRNA and protein of HO-1,γ-GCS and NQO1 increased（P＜0.05）,but the reatment effect of ginsenoside disappeared after HUVECs transfected with Nrf2 siRNA.Conclusion Ginseng may have positive function of anti-oxidative stress on apoptosis of HUVECs exposed to intermittent high glucose by promoting nuclear translocation of Nrf2 and regulating Nrf2/ARE signal.

intermittent high glucose;HUVEC;Nrf2/ARE;oxidative stress;ginseng

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014KYB167）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014ZA045）

浙江省中醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州310006）

陳頡，Tel：13600529637