動物源性食品中抗司帕沙星單克隆抗體的研制與鑒定

曹德玉，郭淼，賈國超，胡驍飛，王方雨，劉珍，楊幸東，張改平

（1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，河南周口466000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；3.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，河南南陽474150）

動物源性食品中抗司帕沙星單克隆抗體的研制與鑒定

曹德玉1，2，郭淼3，賈國超2，胡驍飛2，王方雨2，劉珍2，楊幸東2，張改平2

（1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，河南周口466000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；3.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，河南南陽474150）

為了制備高靈敏、高特異性的司帕沙星（SPFX）單克隆抗體，鑒定免疫學(xué)特性。采用蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)DCC法制備免疫抗原SPFX-BSA和包被抗原SPFX-OVA，免疫BALB/c小鼠，用間接ELISA和阻斷ELISA選出產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)多克隆抗體的的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過多次亞克隆篩選出分泌高敏感的特異性抗SPFX單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備抗SPFX的單克隆抗體并對其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，間接ELISA檢測顯示免疫的6只小鼠效價(jià)均達(dá)1.28:104以上，融合后篩選出四株雜交瘤細(xì)胞株4H 4-C8，4H 4-C4，4H 4-B1和4H 4-E9；其細(xì)胞上清效價(jià)分別為1:1.4×103，1:8.0×102，1:5.0×102，1:6.7×102；4H 4-C8株腹水效價(jià)為1: 2.6×106，抗SPFX的單克隆抗體對SPFX的IC50為31μg/L，且具有較好的特異性。本研究成功合成SPFX人工抗原，制備出優(yōu)質(zhì)的單克隆抗體，為SPFX免疫學(xué)快速檢測方法的建立奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

司帕沙星；人工抗原；單克隆抗體；免疫學(xué)特性

0 引 言

司帕沙星SPFX因其療效好、廉價(jià)易得等特點(diǎn)而在獸醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用[1]。而該類藥物的濫用導(dǎo)致的殘留問題引起人們的重視[2-3]。目前美國禁止SPFX在家禽上使用；我國農(nóng)業(yè)部制定肉品中SPFX最大殘留限量為100μg/kg[7]，目前相關(guān)檢測方法主要有HPLC等理化方法[4-8]，難以滿足快速、簡便的現(xiàn)場檢測要求，故亟待建立相應(yīng)的SPFX檢測方法，對其使用有效監(jiān)控，減少其對人類和環(huán)境的危害。國內(nèi)外已有相關(guān)藥物ELISA方法的研究[9-21]，而國內(nèi)少有SPFX單抗研制報(bào)道。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的抗體尤其是具有均一性和永續(xù)性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提[22-23]。故本研究利用合成人工抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備SPFX的單克隆抗體，為SPFX免疫學(xué)快速檢測方法的建立奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 試劑與溶液

司帕沙星沙星（純度≥99.2%），牛血清白蛋白（BSA），雞卵清蛋白（OVA），弗氏完全佐劑（FCA），弗氏不完全佐劑（FIA），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP），四甲基聯(lián)苯胺（TMB），其他試劑均為AR級。

洗液（PBST）：含體積分?jǐn)?shù)0.05%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS，濃度0.01mol/L，pH值為7.4）；包被液（CBS）：濃度0.05 mol/L（pH值為9.6）的碳酸鹽緩沖液；間接ELISA和阻斷ELISA所用的封閉液：含質(zhì)量濃度50 mL/L豬血清的PBST；TMD底物緩沖液：TM B的醋酸-檸檬酸緩沖液；終止液：2 mol/L的硫酸溶液。

1.1.2 主要儀器

550型酶標(biāo)儀，93-3定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器，U-3000紫外掃描儀（UV），超凈工作臺，3K-18高速冷凍離心機(jī)，AE260電子天平，倒置生物顯微鏡，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3701型CO 2培養(yǎng)箱。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 人工抗原的合成與鑒定

參考賈國超等[24]介紹的方法，采用蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)DCC法合成免疫原SPFX-BSA，合成路線如圖1所示。同理合成包被原SPFX-OVA。用UV和SDS-PAGE電泳鑒定人工抗原偶聯(lián)情況。

圖1 DCC法制備SPFX人工抗原路線

1.3 動物免疫

取6～8周齡BALB/c雌性小鼠6只，背部皮下多點(diǎn)注射免疫，免疫劑量30μg/只，共免疫4次。首免，稀釋后SPFX-BSA與等量FCA混合，在轉(zhuǎn)速為40 000 r/min下乳化10 min；其他3次免疫采用稀釋后SPFX-BSA與等量FIA混合，轉(zhuǎn)速為40000 r/min充分乳化10 min。第四次免疫10 d后，斷尾采血并分離血清待檢測。

1.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.4.1 細(xì)胞融合

在PEG的作用下，將NS0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶5比例融合，然后置于37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，次日檢查有無污染，5 d后換液，8 d后檢測細(xì)胞上清篩選陽性孔。

1.4.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選

融合細(xì)胞培養(yǎng)后，用間接ELISA和阻斷ELISA法篩選出陽性強(qiáng)、特異性好、細(xì)胞生長旺盛的孔進(jìn)行多次亞克隆直至所有克隆鑒定結(jié)果一致。

1.4.3 SPFX單克隆抗體（SPFX mAb）的大量制備

采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)SPFX單克隆抗體[24]。取BALB/c小鼠，腹腔注入滅菌液體石蠟0.5 mL，7～10 d后注入克隆化陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)抽取腹水、純化抗體等步驟后，測定單克隆抗體含量。

1.5 單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定

（1）效價(jià)的鑒定采用間接ELISA測定細(xì)胞上清和mAb效價(jià)。

（2）敏感性鑒定采用阻斷ELISA測定m Ab對SPFX的抑制率。

（3）特異性的鑒定采用以SPFX的同系物和其他競爭物作為抑制劑來測定其交叉反應(yīng)率。

（4）亞型鑒定采用間接競爭ELISA檢測方法，具體步驟按照單克隆抗體亞型檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠免疫試驗(yàn)

經(jīng)免疫，6只小鼠均產(chǎn)生SPFX多克隆抗體，效價(jià)達(dá)到1.28×104以上（圖2），說明BSA-SPFX取得預(yù)期免疫效果，其中3號小鼠血清效價(jià)最高。

圖2 BALB/c小鼠多抗血清效價(jià)

2.2 單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定

2.2.1 效價(jià)測定結(jié)果

篩選出4株優(yōu)質(zhì)雜交瘤細(xì)胞株，命名為為4H 4-C8，4H 4-C4，4H 4-B1，4H 4-E9；其中4H 4-C8細(xì)胞株的上清效價(jià)最高，其誘生腹水效價(jià)為1∶2.6× 106。

表1 SPFX mAb的間接ELISA效價(jià)測定

2.2.2 敏感性測定結(jié)果

將4H 4-C 8株單克隆抗體腹水敏感性在半對數(shù)坐標(biāo)軸上繪成抑制曲線，結(jié)果見圖3，線性回歸方程為y=-0.3321x+0.9953，R2=0.9827，其對SPFX的IC50可以達(dá)到31μg/L，敏感性高。

圖3 單抗4H 4-C8對SPFX的抑制曲線

2.2.3 單克隆抗體亞型的測定結(jié)果

按亞型檢測試劑盒的說明書進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示。圖4中單抗的亞型為IgG 1型。

圖4 SPFXmAb抗體亞型

2.2.4 特異性的測定結(jié)果

SPFX mAb的IC50為31μg/L。由表2可以看出，與同系物的交叉反應(yīng)率小于3.73%，與其他競爭物的交叉反應(yīng)率小于0.15%，結(jié)果證明本研究獲得特異性較強(qiáng)的的SPFX單克隆抗體。

表2 SPFX mAb與其他化合物的交叉反應(yīng)

3 討 論

3.1 SPFX人工抗原的制備

免疫學(xué)快速檢測法相對HPLC等傳統(tǒng)理化檢測方法，具有靈敏、特異、操作簡單、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，是未來快速檢測及大批量現(xiàn)場檢測發(fā)展的主要方向。制備優(yōu)質(zhì)免疫原是建立免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)。SPFX是分子量為392.41 u，屬小分子藥物，與BSA、OVA等大分子蛋白偶聯(lián)后才能具有免疫原性和反應(yīng)原性，進(jìn)而激發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。本研究在DCC的作用下將SPFX上的羧基在DCC的作用下與NHS反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，然后與載體蛋白上的氨基反應(yīng)形成具有免疫原性的人工合成抗原，避免了蛋白分子間的交聯(lián)，提高了偶聯(lián)成功概率。

3.2 單克隆抗體的生產(chǎn)

本研究仍采用體內(nèi)誘生法來誘生單克隆抗體，具有廉價(jià)、高效等特點(diǎn)。接種雜交瘤細(xì)胞前小鼠進(jìn)行腹腔石蠟注射，有效抑制小鼠巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫功能，提高小鼠腹腔接納雜交瘤的能力；11 d后收集腹水，獲得較好的效果。

4 結(jié) 論

本研究利用蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)合成的免疫原SPFX-BSA免疫小鼠獲得多抗血清，應(yīng)用細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)，獲得優(yōu)質(zhì)雜交瘤細(xì)胞株，通過體內(nèi)誘生腹水法制備大量單克隆抗體，經(jīng)免疫學(xué)特性鑒定，所制備的抗SPFX單克隆抗體敏感性高，特異性強(qiáng)，IC50最低達(dá)到31μg/L，為SPFX免疫學(xué)快速檢測方法建立及相應(yīng)檢測產(chǎn)品開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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《中國乳品工業(yè)》雜志摘要寫作要求

1 摘要寫作要求

按報(bào)道性摘要書寫，字?jǐn)?shù)300字左右，以提供文章內(nèi)容梗概為目的，不加評論及補(bǔ)充解釋，摘要中應(yīng)包括研究目的、方法及過程、結(jié)果與結(jié)論、創(chuàng)新性和創(chuàng)新點(diǎn)。中英文摘要內(nèi)容應(yīng)一致。

2 摘要寫作注意事項(xiàng)

2.1 著重反映新內(nèi)容和特別強(qiáng)調(diào)的觀點(diǎn)。

2.2 排除在本學(xué)科領(lǐng)域已成常識的內(nèi)容。

2.3 不得簡單地重復(fù)題名中已有的信息。

2.4 書寫要合乎語法、保持上下文的邏輯關(guān)系。

2.5 結(jié)構(gòu)要嚴(yán)謹(jǐn)，表達(dá)要簡明，語義要確切，不分段落。

2.6 用第三人稱的寫法。應(yīng)采用“對……進(jìn)行了研究”、“報(bào)告了……現(xiàn)狀”、“進(jìn)行了……調(diào)查”等記述方法，不要使用“本文”、“作者”等為主語。

2.7 采用規(guī)范化的名詞術(shù)語（包括地方、機(jī)構(gòu)名和人名）。

2.8 縮略語、略稱、代號，除了相鄰專業(yè)的讀者也能清楚理解的以外，在首次出現(xiàn)處必須加以說明。

3 英文摘要寫作注意事項(xiàng)

3.1 避免在摘要的第一句重復(fù)使用題目或題目的一部分。

3.2 用簡潔、明確的語言（一般不超過150個單詞），盡量用短句并避免句型單調(diào)。

3.3 描述作者的工作一般用過去時(shí)態(tài)，陳述由這些工作所得的結(jié)論時(shí)用現(xiàn)在時(shí)態(tài)。

3.4 盡量用主動語態(tài)代替被動語態(tài)。

3.5 盡量用語義清楚并為人熟知的詞匯，對于大眾熟知的縮寫語可直接使用。

Preparation and identification of a monoclonal antibody against sparfloxacin in animal food

CAO De-yu1，2，GUO Miao3，JIA Guo-chao2，HU Xiao-fei2，WANG Fang-yu2，LIU Zhen2，YANG Xin-dong2，ZHANG Gai-ping2

（1.Department of Biological Engineering，Zhoukou Vocational and Technical College，Zhoukou 466000，China；2.Key Laboratory for Animal Immunology of the ministry of Agriculture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.Department of Agronomy，Nanyang Vocational College of agriculture，Nanyang 474150，China）

The aim of the study is to generate high sensitivity and high specificity monoclonal antibody against Sparfloxacin and identification of its immunological characteristics.The artificial immunogen SPFX-BSA and coating antigen SPFX-OVA were obtained using the method of DCC by linking carrier proteins bovine serum albumin（BSA）and ovalbumin（OVA）to Sparfloxacin.Then immune BALB/c mouse，The titer and sensitivity of polyclonal antibody was detected by indirect ELISA and blocking ELISA after four times immunization.The high titer and high sensitivity mouse was selected for cell fusing.High sensitivity and high specificity monoclonal antibody was prepared after mang times subcloning，and immunological characterization were characterized.The preparation of ascites was carried out using in vivo induction method.Indirect ELISA showed a high titer above 1.28×104of the antiserum of all the six BALB/cmouse.Four hybridoma cell lines of 4H4-C8、4H4-C4、4H 4-B1 and 4H4-E9were screened after cell fusing，the indirect ELISA titer of the mAb were 1∶1.4×103、1∶8.0×102、1∶5.0×102、1∶6.7×102in supernatant and 1∶2.6×106in ascites.The special mAb showed good sensitivity with IC50of 31μg/L to Sparfloxacin.This test was synthesized successfully SPFX artificial antigens and obtained high sensitivity and specificity monoclonal antibody.It laid a foundation base for the SPFX immunology fast detection methods.

sparfloxacin;artificial antigen;monoclonal antibody;immunological trait

S859.84

A

1001-2230（2015）05-0018-04

2015-11-05

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003008-09）。

曹德玉（1968-），男，副教授，主要研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。