艱難梭菌分子分型方法研究進(jìn)展

李志榮趙建宏

(1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院, 河北 石家莊 050000；2 河北省臨床檢驗中心, 河北 石家莊 050000)

·綜述·

艱難梭菌分子分型方法研究進(jìn)展

李志榮1, 2趙建宏1, 2

(1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院, 河北 石家莊 050000；2 河北省臨床檢驗中心, 河北 石家莊 050000)

艱難梭菌; 分子分型; 分子流行病學(xué)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile, CD)是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)它是引起抗生素相關(guān)性假膜性腸炎的原因之一，由其引起的艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)現(xiàn)已成為抗生素相關(guān)性腹瀉的主要原因[1-2]。CDI可表現(xiàn)為從輕度的自限性腹瀉到嚴(yán)重的假膜性腸炎甚至死亡。在過去的十多年中，CD的流行病學(xué)情況發(fā)生了變化，自2004年起在北美和歐洲相繼出現(xiàn)了CD強(qiáng)毒株：NAP-1/027/ST1[3-4]。到2008年，又發(fā)現(xiàn)了另一強(qiáng)毒株P(guān)CR RT078/NAP 07-08/ST11的傳播流行[5]。快速、準(zhǔn)確的分子分型對CD暴發(fā)流行的早期監(jiān)測和追蹤溯源具有重要意義。本文對常用的CD分型方法及其最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CD分型的歷史回顧

CD常用的分型技術(shù)可分為2類：表型分型和基因型分型。血清型分型法是20世紀(jì)80年代中期常用的表型分型方法，采用玻片凝集的原理，該方法最初能夠分出6個不同的CD血清型[6]，經(jīng)進(jìn)一步改進(jìn)后可分出15種型別[7]。傳統(tǒng)的其他表型分型方法還包括免疫印跡法分型[8]、細(xì)菌素/噬菌體分型[9]、抗菌譜分型[10]等。表型分型方法比較直觀，但是具有重復(fù)性低、分型率低和分辨力不足等缺點。20世紀(jì)90年代出現(xiàn)基因分型技術(shù)，因其具有更好的分型率和分辨力，使之逐步取代表型分型技術(shù)[11]?；蛐头中图夹g(shù)分為基于電泳條帶和基于序列2種類型。最常用基于電泳條帶型的技術(shù)包括限制性內(nèi)切酶分析(restriction endonuclease analysis, REA)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、毛細(xì)管或常規(guī)PCR核糖體分型(PCR-ribotyping, PCR RT)和多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)。近年來被實驗室推崇的基于序列分析的分型技術(shù)為多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。此外，以序列分析為基礎(chǔ)的全基因組測序技術(shù)(whole genome sequencing, WGS)也逐漸興起，成為研究CD菌株之間差異(如單核苷酸多態(tài)性分析)的分型技術(shù)。

2 常用的CD分型方法

2.1 PCR RT PCR RT是CD最常用的分子分型技術(shù)之一。由Gürtler等人首次創(chuàng)建，分型依據(jù)是根據(jù)16S和23S rDNA之間的間隔區(qū)變異性(intergenic spacer region, ISR)[12]。所使用的引物以16S rRNA基因的3’端和23S rRNA基因的5’端保守區(qū)為目標(biāo)設(shè)計。因為CD基因組包含多個16S—23S rRNA操縱子，其數(shù)量和間隔區(qū)大小的不同使得PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳分離得到的電泳帶型稱為核糖體型?，F(xiàn)在用于CD的PCR RT的引物有兩種[13-14]。其中，Stubbs等人所描述的O’ Neill 引物比Bidet引物的分辨力更好。分辨力是指區(qū)分無關(guān)菌株的能力，其數(shù)據(jù)基于辛普森指數(shù)(Simpson index, SI)[15]。采用O’ Neill引物進(jìn)行分型時，PCR產(chǎn)物的大小通常為250～600 bp，然后由瓊脂糖凝膠電泳或最近研究的毛細(xì)管電泳分離，從而達(dá)到分型目的。在歐洲，PCR核糖型的命名原則是UK(United Kingdom)加三位數(shù)的后綴(如UK001)。毛細(xì)管電泳核糖型別則為前綴CE加上三位數(shù)的后綴(即CE001)。然而，由于PCR核糖體型別的判定需要與參考菌株進(jìn)行電泳譜型對比，不易在實驗室間統(tǒng)一實現(xiàn)。因此，當(dāng)前很多實驗室也會依據(jù)本實驗室的菌株型別進(jìn)行排序命名(如本實驗室的型別命名以HB加上兩位數(shù)的后綴而成)[16]。迄今為止，PCR RT能夠識別400多種不同的CD類型。

2.2 PFGE分型 在北美地區(qū)，PFGE曾是最常用的CD分子分型技術(shù)之一。PFGE利用稀有酶切位點限制性內(nèi)切酶(例如SmaI)對細(xì)菌染色體組DNA進(jìn)行消化，通過在3個不同方向的脈沖電場，從而使細(xì)菌DNA片段得以有效分離。由于在電泳過程中的脈沖方向呈線性增加，可以逐步使更大的片段能夠通過凝膠遷移，從而可以區(qū)分傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳下不能分辨的大片段DNA。PFGE所得到的指紋譜型被稱為NAP型。型別類型使用前綴NAP(北美脈沖場型)后跟一個數(shù)字表示脈沖場型的分組和一個字母表示的亞組(即NAP 1b)。

盡管儀器設(shè)備昂貴，操作程序復(fù)雜和運行緩慢，但在美國PulseNet的大力推動下，PFGE分型方法仍在20世紀(jì)90年代成為北美地區(qū)大多數(shù)CD病原體的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于細(xì)菌DNA的降解導(dǎo)致許多CD無法被分型。此外，PFGE的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和應(yīng)用還需要進(jìn)一步的優(yōu)化[17]。

有報道稱PFGE比PCR RT具有更好的分辨力(SI值分別為0.843和0.688)[18]。然而，另一項關(guān)于PCR RT初步分型技術(shù)比對的研究中，最常見的39個PCR RT型，卻只能被分為16個PFGE類型。所有基于電泳指紋圖譜分型面臨的共同問題是對電泳條帶的識別，尤其是當(dāng)條帶的譜型差別不大的時候。因此，如何定義PFGE和PCR的不同型別對于識別新的型別非常必要。在歐洲，新的PCR核糖體型別常由參考實驗室來驗證。早期的20個PCR RT型分離自多個歐洲國家，遍布?xì)W洲艱難梭菌感染研究網(wǎng)絡(luò)(EuropeanClostridiumdifficileinfection surveillance network, ECDIS-NET)的各參考實驗室[19]。

2.3 MLST分型 MLST于2004年首次用于CD群體構(gòu)成和全球流行病學(xué)研究[20]。該方法是基于基因測序的分子分型方法，通常測序的片段是七個長度約在300 bp和500 bp之間的管家基因(MLST 7HG)。根據(jù)每個管家基因的序列變異情況，分配給它一個不同的等位基因編碼，這樣七個等位基因的編碼組合就形成了一個序列類型(ST型)。將MLST分型方法產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)上傳至一個全球?qū)嶒炇夜玫腤eb數(shù)據(jù)庫，即可方便不同實驗室對ST型的確定、研究CD的群落構(gòu)成和全球流行情況。目前，有2種不同的MLST分型方案[20-21]，這2種分型方案都包括7個管家基因，其中3個基因位點在2個方案中都被應(yīng)用到(triosephosphate isomerase,tpi; recombinase A,recA; superoxide dismutase A,sodA)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Lemee方案中的丙氨酸連接酶(DDL)位點是一個無效的等位基因，因此應(yīng)用較少。而Griffiths分型方案則被廣泛應(yīng)用[21]。據(jù)報道，MLST和PCR RT方法的分辨力是相當(dāng)?shù)腫18, 21]。

相比基于電泳指紋圖譜的分型方法(如PCR RT)，MLST更不容易受到基因重組的影響。一個管家基因的重組僅會改變單一基因位點，這使得即便產(chǎn)生了新的ST型，仍會與原始的ST型保持較近的親緣關(guān)系，也就維護(hù)了系統(tǒng)進(jìn)化分析的相關(guān)性。用MLST進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，可將CD至少分成5個不同的進(jìn)化分支[21]，而位于第6個分支的菌株可能是單系進(jìn)化[22]。多數(shù)ST型都屬于第一分支，而且這一分支無主要的亞分支。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與分型方案選擇的管家基因位點相關(guān)。選擇不同的管家基因或者在當(dāng)前的MLST方案中加入新的管家基因，或許可增加對位于第一分支的菌株的分析效果。

基于測序的MLST分型方法的一個主要優(yōu)勢是其所得出的數(shù)據(jù)易于解釋。測序的數(shù)據(jù)比較明確、客觀，具有高度重復(fù)性，并易于實驗室間的交流。此外，不同實驗室可將自己的測序數(shù)據(jù)提交至MLST數(shù)據(jù)庫。截至2016年1月11日，數(shù)據(jù)庫中已有可明確的331個ST型。MLST存在的比較現(xiàn)實的缺陷是其測序的成本相對較高，這可能是在許多歐洲實驗室并未用MLST取代傳統(tǒng)的PCR RT的原因之一。

2.4 MLVA MLVA是一種具有高分辨力的分子分型方法，通常被應(yīng)用于研究細(xì)菌暴發(fā)流行和追蹤病原體傳播途徑[5, 23-24]。其分型原理是通過軟件尋找散在分布于細(xì)菌基因組中的大小不等的短串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，并設(shè)計相應(yīng)引物對其擴(kuò)增，用毛細(xì)管電泳自動分析擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)其串聯(lián)重復(fù)序列可變重復(fù)數(shù)目，分配給不同菌株一定的數(shù)組，據(jù)此判定為不同的MLVA型別。通過計算匯總串聯(lián)重復(fù)序列的差異(summed tandem repeat difference, STRD)可構(gòu)建最小生成樹(minimum spanning tree，MST)。STRD≤2的菌株定義為一個克隆群，STRD≤10的菌種認(rèn)為是一個基因相關(guān)群[5, 25]。Broukhanski等[25]研究發(fā)現(xiàn)艱難梭菌MLVA方案中有兩個位點(F3和H9)在不同菌株間沒有差異，表明這兩個位點在CD分型上無任何作用。此外，Bakker等[26]報道，MLVA的A6位點對于PCR RT078是無效位點。因此，對PCR RT078型菌株的分析，需要進(jìn)一步優(yōu)化其他幾個位點的PCR設(shè)置。目前，MLVA被認(rèn)為是CD流行病學(xué)研究最有效的分型方法，并應(yīng)用于荷蘭、法國和英國的027型暴發(fā)流行研究。還有英國學(xué)者采用MLVA方法探討了CDI病例的潛在聯(lián)系[27]。值得注意的是，該研究結(jié)果顯示，原本被認(rèn)為是屬于同一種群的菌株，幾乎有一半是由無關(guān)菌株組成，或者是由相關(guān)和無關(guān)的菌株混合組成。

3 艱難梭菌分型方法的新進(jìn)展

3.1 MLVA進(jìn)展 有學(xué)者提出一個改進(jìn)的MLVA(modified MLVA, mMLVA)方案，將MLVA與PCR檢測艱難梭菌毒素基因相結(jié)合(tcdA,tcdB,cdtB和tcdC)[24]。該方案將MLVA位點數(shù)量限定為5個，去除F3和H9位點。盡管結(jié)合毒素基因檢測后的分型方案信息量更大，但目前還無法將這些數(shù)據(jù)與PCR RT027/ NAP01等特定型別相關(guān)聯(lián)。其原因可能是因為二元毒素基因與tcdC基因缺失的并存現(xiàn)象并不只存于PCR RT027菌株[24, 28]。而在Manzoor等[29]的研究中將MLVA方案所用的基因位點數(shù)目增加至15個，擴(kuò)展后的MLVA(extended MLVA, eMLVA)方案可區(qū)分臨床上的主要集群，與PCR RT具有良好的一致性。而僅含有7個位點的MLVA方案[25-26]與PCR RT相關(guān)性較差，7個位點MLVA只能結(jié)合PCR RT方法作為亞型分型方法使用，而eMLVA則可同時取代兩者。但是，隨著位點數(shù)目的增加，該方法也更費力，而且增加了數(shù)據(jù)的解釋難度。

為創(chuàng)建一個可提供滿意分析的數(shù)據(jù)，并與PCR RT保持良好的一致性MLVA方案，Wei等[30]篩選了40個MLVA位點用于研究CD暴發(fā)流行。研究結(jié)果表明，由多樣性較低的等位基因位點組成的MLVA方案與PCR RT相關(guān)性高，而多樣性較高的位點組成的分型方案則可用于CD暴發(fā)流行研究。這兩個分型方案，分別包括10個多樣性有限的等位基因位點和4個高度多樣性的等位基因位點。

3.2 高分辨毛細(xì)管凝膠電泳核糖體分型(capillary gel electrophoresis-based PCR ribotyping， CE-PCR RT) 雖然PCR RT已經(jīng)被許多歐洲實驗室廣泛應(yīng)用于CD監(jiān)測，但是由于指紋圖譜的不易解釋和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫等問題，這一方法的應(yīng)用傳播仍有較大局限。而CE-PCR RT的應(yīng)用大大提高了其重復(fù)性和可解釋性。例如，傳統(tǒng)的基于瓊脂糖凝膠電泳的PCR RT很難區(qū)分014型和020型CD。而CE-PCR RT則不僅可以區(qū)分014型和020型，還能將014型進(jìn)一步分出亞型[31]。美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)、加拿大衛(wèi)生公署、荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心和英國利茲教學(xué)醫(yī)院的CD監(jiān)測，探討了CE-PCR RT的DNA提取、引物設(shè)計、PCR循環(huán)條件及參考標(biāo)準(zhǔn)等操作流程，并采用標(biāo)準(zhǔn)一致的操作流程對70個不同的RT型進(jìn)行了檢測[24]。初步結(jié)果表明分型結(jié)果在不同實驗室之間較為一致。

3.3 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-light mass, MALDI-TOF MS)分型 MALDI-TOF MS以其在微生物的鑒定、耐藥性和毒力監(jiān)測中快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、高通量等特點，近年來越來越受到人們的關(guān)注。它不僅能夠鑒定病原體種/亞種水平，還具有良好的分型能力，逐漸被應(yīng)用到細(xì)菌、真菌和病毒的分型中[32]。其分型原理是建立在MALDI-TOF MS鑒定微生物的基礎(chǔ)上，利用核心圖譜(the main spectra, MSP)建造標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜庫，采用主成分分析(principal component analysis, PCA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖是以檢測到的離子質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標(biāo)，離子峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)構(gòu)建而成，通過將檢測到的病原體鑒定質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫圖譜比對，從而實現(xiàn)對目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定[33]。圖譜中主要的分子離子峰為菌體內(nèi)高豐度、表達(dá)穩(wěn)定、進(jìn)化保守的核糖體蛋白，所以，可以通過聚類分析獲得微生物間的進(jìn)化和親緣關(guān)系。Rettinger等[34]采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜指紋圖譜分型方法、16S rRNA測序方法和MLST方法對28株鉤端螺旋體進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜指紋圖譜能很好地區(qū)分高致病性(21株)、中間型(3株)和非致病性(4株)的鉤端螺旋體。與16S rRNA測序方法得到的進(jìn)化樹結(jié)果相同，同一型內(nèi)各菌株之間相似性很高，但MLST方法卻只能區(qū)分中間型鉤端螺旋體，高致病性和非致病性的菌株都?xì)w于一類。目前有研究人員正在探討MALDI-TOF MS在CD分型中的應(yīng)用[35]。

3.4 二元基因分型 二元基因分型是近年來用于微生物分型的一種新興的分子分型方法，已經(jīng)成功應(yīng)用于金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌的流行病學(xué)研究[36-37]。其分型原理是根據(jù)某一個基因在細(xì)菌DNA的存在與否，都能將一組細(xì)菌分成2個類型，當(dāng)結(jié)合多個這樣的基因位點進(jìn)行分析時就可將一組細(xì)菌進(jìn)行有效的分型，這樣的基因位點又被稱為二元基因。如果選擇的基因位點是與毒力和耐藥等功能相關(guān)的基因時，二元基因分型方法不僅可追蹤流行菌株的傳播途徑，還可讓臨床醫(yī)生直觀地了解從患者樣本中分離到菌株的功能基因，以便采取進(jìn)一步的治療措施。近期，我實驗室成功創(chuàng)建了CD二元基因分型方法，通過方法學(xué)對比研究發(fā)現(xiàn)，10位點二元基因分型不僅具有操作簡便、費用低、易于分析和數(shù)據(jù)共享等優(yōu)點，而且其分辨力也優(yōu)于核糖體分型和MLST，顯示了良好的應(yīng)用前景。

3.5 WGS分型 高通量、全基因組測序技術(shù)應(yīng)用的范圍和可靠性已足以準(zhǔn)確調(diào)查病原體的毒力、流行路徑和菌群結(jié)構(gòu)分布[38]。通過對成百上千的基因組系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和比較基因組學(xué)分析，可準(zhǔn)確地確定細(xì)菌的遺傳學(xué)變化，而且容易發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)與毒力和耐藥性表型的關(guān)系，因此，可快速地了解病原體的生物學(xué)特征[39]。通過比較單個核苷酸的多態(tài)性，WGS可區(qū)分菌株間單個核苷酸水平的差別，因此具有極高的分辨力。另外，通過預(yù)測病原體出現(xiàn)的選擇性壓力和追蹤病原體流行傳播，WGS在臨床微生物學(xué)和公共衛(wèi)生流行病學(xué)領(lǐng)域也有很高的實用價值。

盡管WGS的應(yīng)用仍然受到設(shè)備、數(shù)據(jù)分析等條件的限制，但該方法代表了病原體分型的終極方法。在未來幾年，WGS將會成為一種常用CDI監(jiān)測及流行病學(xué)工具。雖然與傳統(tǒng)的分型方法相比WGS成本相對較高，但是隨著CD基因組數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和后期的信息學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理學(xué)分析等標(biāo)準(zhǔn)計算程序[40]的發(fā)展，WGS數(shù)據(jù)處理的成本正在迅速下降[12, 41]。此外，1次WGS檢測得出的信息量可同時推斷MLST、PFGE、耐藥基因、毒素基因序列和其他數(shù)據(jù)，從這個角度來講，它可以平衡成本效益，也預(yù)示著它可能是一種終極的分型方法。

首次應(yīng)用高通量WGS測序技術(shù)對PCR RT027系統(tǒng)進(jìn)化樹研究結(jié)果顯示，通過SNP分析可將采集自美國和歐洲的25個PCR RT027菌株進(jìn)一步分成25不同的基因型。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)美國和歐洲不同地區(qū)的菌株擁有獨特的進(jìn)化譜系和抗菌藥物耐藥基因。有證據(jù)表明[42]，PCR RT027型菌株獲得相同的耐藥突變后出現(xiàn)了兩條不同的流行譜系，這兩譜系在全球傳播時呈現(xiàn)了不同的流行模式。K?ser等[43]的研究將WGS測序在診斷學(xué)和流行病學(xué)研究中的應(yīng)用顯示了很好的效果。這項研究指出，基因組SNP分型主要可用于監(jiān)測暴發(fā)和病原菌傳播途徑的識別。當(dāng)前用于監(jiān)測CD醫(yī)院相關(guān)感染暴發(fā)的方法，比如PCR RT方法的分辨力有限，不能識別暴發(fā)流行的菌株是否來自同一克隆株，而全基因組測序則有很好的分辨力，可以追蹤病原菌在醫(yī)院，醫(yī)院病房和同一個病房的患者之間的傳播路徑。

Eyre等[44]研究表明，WGS可產(chǎn)生實用的、與臨床直接相關(guān)的數(shù)據(jù)，在一定時間內(nèi)研究結(jié)果有助于患者管理，從而在疾病暴發(fā)初期實現(xiàn)感染控制。這項研究中通過WGS檢測發(fā)現(xiàn)，由相同ST型CD造成的醫(yī)院相關(guān)性艱難梭菌感染，實際上可能是一組相互間沒有進(jìn)化關(guān)系的CD所導(dǎo)致，因此可排除其在患者之間傳播的可能。而且，與比較基因組學(xué)相結(jié)合，WGS是發(fā)現(xiàn)與潛在毒力相關(guān)的新的遺傳標(biāo)志的有效方法。這是一個超越傳統(tǒng)分型方法的重要優(yōu)點，因為傳統(tǒng)方法只能利用現(xiàn)有的菌株特性標(biāo)記進(jìn)行分析。

5 未來展望

在過去的15年中，由于基于測序的分子分型方法具有較好的分辨力，以及分型結(jié)果的易于解釋和相互交流，使其取代了一些更為傳統(tǒng)的分型方法。而WGS則有可能主導(dǎo)未來十年的分子分型領(lǐng)域。然而，在WGS可作為分子分型的常規(guī)方法之前仍需要有更多的研究數(shù)據(jù)支持。首先，WGS需要在48 h內(nèi)快速、有效地完成。其次，數(shù)據(jù)分析等技術(shù)流程仍需要進(jìn)一步簡化。最后，WGS技術(shù)的運行和組織平臺成本必須降低。如果滿足這些要求將大大增加WGS在全球的使用，這可能只是一個時間的問題。

[1] Bartlett JG. Antibiotic-associated pseudomembranous colitis[J]. Hosp Pract (Off Ed), 1981, 16(12): 85-98, 93-95.

[2] Jacob J, Wu J, Han J, et al.Clostridiumdifficilein an urban, university-affiliated long-term acute-care hospital[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38(3): 294-299.

[3] Schwan C, Stecher B, Tzivelekidis T, et al.Clostridiumdifficiletoxin CDT induces formation of microtubule-based protrusions and increases adherence of bacteria[J]. PLoS Pathog, 2009, 5(10): e1000626.

[4] Rupnik M, Tambic Andrasevic A, Trajkovska Dokic E, et al. Distribution ofClostridiumdifficilePCR ribotypes and high proportion of 027 and 176 in some hospitals in four South Eastern European countries[J]. Anaerobe, 2016, 42:142-144.

[5] Goorhuis A, Bakker D, Corver J, et al. Emergence ofClostridiumdifficileinfection due to a new hypervirulent strain, polymerase chain reaction ribotype 078[J]. Clin Infect Dis, 2008, 47(9): 1162-1170.

[6] Delmee M, Homel M, Wauters G. Serogrouping ofClostridiumdifficilestrains by slide agglutination[J]. J Clin Microbiol, 1985, 21(3): 323-327.

[7] Tabaqchali S, Holland D, O’Farrell S, et al. Typing scheme forClostridiumdifficile: its application in clinical and epidemiological studies[J]. Lancet, 1984, 1(8383): 935-938.

[8] Mulligan ME, Peterson LR, Kwok RY, et al. Immunoblots and plasmid fingerprints compared with serotyping and polyacrylamide gel electrophoresis for typingClostridiumdifficile[J]. J Clin Microbiol, 1988, 26(1): 41-46.

[9] Sell TL, Schaberg DR, Fekety FR. Bacteriophage and bacteriocin typing scheme forClostridiumdifficile[J]. J Clin Microbiol, 1983, 17(6): 1148-1152.

[10] Cartmill TD, Orr K, Freeman R, et al. Nosocomial infection withClostridiumdifficileinvestigated by pyrolysis mass spectrometry[J]. J Med Microbiol, 1992, 37(5): 352-356.

[11] Cohen SH, Tang YJ, Silva J Jr. Molecular typing methods for the epidemiological identification ofClostridiumdifficilestrains[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2001, 1(1): 61-70.

[12] Gürtler V. Typing ofClostridiumdifficilestrains by PCR-amplification of variable length 16S-23S rDNA spacer regions[J]. J Gen Microbiol, 1993, 139(12): 3089-3097.

[13] van den Berg RJ, Claas EC, Oyib DH, et al. Characterization of toxin A-negative, toxin B-positiveClostridiumdifficileisolates from outbreaks in different countries by amplified fragment length polymorphism and PCR ribotyping[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(3): 1035-1041.

[14] Stubbs SL, Brazier JS, O’Neill GL, et al. PCR targeted to the 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region ofClostridiumdifficileand construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(2): 461-463.

[15] Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity[J]. J Clin Microbiol, 1988, 26(11): 2465-2466.

[16] Tian TT, Zhao JH, Yang J, et al. Molecular characterization ofClostridiumdifficileisolates from human subjects and the environment[J]. PLoS One, 2016, 11(3): e0151964.

[17] Centers for Disease Control and Prevention. 20 yeays of PulseNet[EB/OL]. (2016-10-03) [2016-11-01]. http://www.cdc.gov/ pulsenet/.

[18] Killgore G, Thompson A, Johnson S, et al. Comparison of seven techniques for typing international epidemic strains ofClostridiumdifficile: restriction endonuclease analysis, pulsed-field gel electrophoresis, PCR-ribotyping, multilocus sequence typing, multilocus variable-number tandem-repeat analysis, amplified fragment length polymorphism, and surface layer protein A gene sequence typing[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46 (2): 431-437.

[19] Bauer MP, Notermans DW, van Benthem BH, et al.Clostridiumdifficileinfection in Europe: a hospital-based survey[J]. Lancet, 2011, 377(9759): 63-73.

[20] Lemee L, Dhalluin A, Pestel-Caron M, et al. Multilocus sequence typing analysis of human and animalClostridiumdifficileisolates of various toxigenic types[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(6): 2609-2617.

[21] Griffiths D, Fawley W, Kachrimanidou M, et al. Multilocus sequence typing ofClostridiumdifficile[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(3): 770-778.

[22] Knetsch CW, Terveer EM, Lauber C, et al. Comparative analysis of an expandedClostridiumdifficilereference strain collection reveals genetic diversity and evolution through six lineages[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(7): 1577-1585.

[23] Eckert C, Vromman F, Halkovich A, et al. Multilocus variable-number tandem repeat analysis: a helpful tool for subtyping FrenchClostridiumdifficilePCR ribotype 027 isolates[J]. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 8): 1088-1094.

[24] Fawley WN, Freeman J, Smith C, et al. Use of highly discriminatory fingerprinting to analyze clusters ofClostridiumdifficileinfection cases due to epidemic ribotype 027 strains[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(3): 954-960.

[25] Broukhanski G, Low DE, Pillai DR. Modified multiple locus variable-number tandem-repeat analysis for rapid identification and typing ofClostridiumdifficileduring institutional outbreaks[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(5): 1983-1986.

[26] Bakker D, Corver J, Harmanus C, et al. Relatedness of human and animalClostridiumdifficilePCR ribotype 078 isolates based on multilocus variable-number tandem-repeat analysis and tetracycline resistance[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(10): 3744-3749.

[27] Fawley WN, Wilcox MH. An enhanced DNA fingerprinting service to investigate potentialClostridiumdifficileinfection case clusters sharing the same PCR ribotype[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(12): 4333-4337.

[28] Janvilisri T, Scaria J, Thompson AD, et al. Microarray identification ofClostridiumdifficilecore components and divergent regions associated with host origin[J]. J Bacteriol, 2009, 191(12): 3881-3891.

[29] Manzoor SE, Tanner HE, Marriott CL, et al. Extended multilocus variable-number tandem repeat analysis ofClostridiumdifficilecorrelates exactly with ribotyping and enables identification of hospital transmission[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(10): 3523-3530.

[30] Wei HL, Kao CW, Wei SH, et al. Comparison of PCR ribotyping and multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for improved detection ofClostridiumdifficile[J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 217.

[31] Indra A, Huhulescu S, Schneeweis M, et al. Characterization ofClostridiumdifficileisolates using capillary gel electrophoresis-based PCR ribotyping[J]. J Med Microbiol, 2008, 57(Pt 11): 1377- 1182.

[32] 靳穎, 王俊妨, 崔云濤,等. 基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜在臨床病原菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國感染與化療雜志, 2014,12(3):238～240.

[33] Fenselau C, Demirev PA. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry[J]. Mass Spectrom Rev, 2001, 20(4): 157-171.

[34] Rettinger A, Krupkal, Grünwald K, et al.Leptospiraspp. strain identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene sequencing and multi locus sequence typing(MLST)[J]. BMC Microbiol, 2012, 12: 185.

[35] Rizzardi K, ?kerlund T. High molecular weight typing with MALDI-TOF MS-A novel method for rapid typing ofClostridiumdifficile[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0122457.

[36] Zadoks R, van Leeuwen W, Barkema H, et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and humanStaphylococcusaureusisolates [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(5): 1931-1939.

[37] Huang B, Zhao D, Fang NX, et al. An optimized binary typing panel improves the typing capability forCampylobacterjejuni[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013, 77(4): 312-315.

[38] Croucher NJ, Harris SR, Fraser C, et al. Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions[J]. Science, 2011, 331(6016): 430-434.

[39] Harris SR, Clarke IN, Seth-Smith HM, et al. Whole-genome analysis of diverseChlamydiatrachomatisstrains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing[J]. Nat Genet, 2012, 44(4): 413-419.

[40] Dannheim H, Riedel T, Neumann-Schaal M, et al. Manual curation and reannotation of the genomes ofClostridiumdifficile630Δerm andC.difficile630[J]. J Med Microbiol, 2017, 66(3): 286-293.

[41] Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(1): 31-46.

[42] He M, Miyajima F, Roberts P, et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associatedClostridiumdifficile[J]. Nat Genet, 2012, 45(1): 109-113.

[43] K?ser CU, Ellington MJ, Cartwright EJ, et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(8): e1002824.

[44] Eyre DW, Golubchik T, Gordon NC, et al. A pilot study of rapid benchtop sequencing ofStaphylococcusaureusandClostridiumdifficilefor outbreak detection and surveillance[J]. BMJ Open, 2012, 2(3), pii: e001124.

(本文編輯：熊辛睿)

Advances in molecular typing ofClostridiumdifficile

(LI Zhi-rong)1, 2, (ZHAO Jian-hong)1, 2

(1The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China； 2 Hebei Provincial Center for Clinical Laboratory, Shijiazhuang 050000, China)

2016-06-15

科技部課題資助項目(2005DKA21202-6)；河北省科技廳資助項目(10966142D)；河北省自然科學(xué)基金資助項目(H2013206450)

李志榮(1985-)，男(漢族)，河北省邯鄲市人，主管檢驗師，主要從事臨床微生物致病及耐藥機(jī)制研究。

趙建宏 E-mail:zhaojh_2002@yahoo.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.04.023

R378.8

A

1671-9638(2017)04-0377-06