阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實驗研究進(jìn)展

蘇菲 桑宏勛

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病，其病理特征為骨量降低、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，骨強(qiáng)度下降，易發(fā)生骨折；與年齡、性別、種族等因素密切相關(guān)，絕經(jīng)后婦女多發(fā)[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(POP)是由于婦女絕經(jīng)后，卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平隨之下降，雌激素的骨骼效應(yīng)消除后，破骨細(xì)胞的骨吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成作用導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松[2]。尤其絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥和骨折并發(fā)癥發(fā)病率更高，男女比率約1∶8[3]。目前，骨質(zhì)疏松性骨折的治療包括外科干預(yù)、積極應(yīng)用藥物治療及功能鍛煉等。治療骨質(zhì)疏松藥物種類很多，但存在著許多的問題，如副作用較大，費用較高等。

阿司匹林(Aspirin)是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，早在公元前5世紀(jì)，古希臘醫(yī)生希波克拉底已從柳樹皮提取的苦味粉末用來鎮(zhèn)痛、退燒。傳統(tǒng)臨床應(yīng)用中， 解熱鎮(zhèn)痛、消炎抗風(fēng)濕是其常用的范疇，后來又發(fā)現(xiàn)其有抗凝血、消炎等作用，從而應(yīng)用于心腦血管疾病中，降低心腦血管疾病的發(fā)生率及死亡率[4-7]。這一百年老藥的新用途仍在不斷地被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。阿司匹林臨床上還可用來治療糖尿病[8]、抗腫瘤[9]、防治老年性白內(nèi)障、治療膽道蛔蟲病、提高妊娠成功率、降低流產(chǎn)發(fā)生。此外阿司匹林在農(nóng)業(yè)上有抗旱能力，提高種子發(fā)芽率，預(yù)防農(nóng)作物病害，減少作物落花落果，改善農(nóng)作物品質(zhì)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量等作用。

近年來，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可提高老年人的骨密度[10,11]，從而推斷其可治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。阿司匹林有多種生物學(xué)途徑，如有抑制COX1、COX2和PG2活動等，目前還沒能完全闡明阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松詳細(xì)的功能機(jī) 制，有以下多種可能與治療骨質(zhì)疏松相關(guān)的生物學(xué)途徑：①抑制Fas抗體誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的死亡，誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞的死亡；②抑制去勢小鼠成纖維細(xì)胞集落單位的生成和誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖；③增加Runx2基因的表達(dá)，從而提高骨髓間質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性和長度；④降低酸性磷酸酶活性；⑤減少RANKL表達(dá)，增加OPG的水平；⑥加速退化磷酸β-蛋白的降解，增加Wnt信號的水平[12]。在此方面，實驗研究取得了一定進(jìn)展。阿司匹林是一種老藥，不但副作用較少、廉價，而且治療疾病的范圍廣。因此探討阿司匹林對骨質(zhì)疏松的作用及其機(jī)制意義重大，筆者將對阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的實驗研究進(jìn)展做一綜述。

1 POP動物模型的構(gòu)建

目前構(gòu)建POP的動物模型多使用Sprague-Dawley(SD)或者Wistar雌性大鼠，在適當(dāng)?shù)膶嶒灄l件下適應(yīng)一段時間，通過摘除雙側(cè)卵巢模擬女性絕經(jīng)，摘除卵巢后的雌性大鼠，因雌激素下降，形成以松質(zhì)骨丟失為主的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，這一特點與臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制相似[13-15]。

2 阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的實驗研究

2.1 在體實驗

在體實驗研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)及骨生物力學(xué)、骨代謝指標(biāo)等均有調(diào)節(jié)作用。

2.1.1提高骨密度：Yamaza等[12]用低劑量阿司匹林研究其對去勢鼠的骨密度影響。對3月齡的去勢鼠進(jìn)行為期3個月低劑量阿司匹林治療，然后使用顯微CT分析發(fā)現(xiàn)，阿司匹林治療組顯著改善去勢小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨密度。Chen等[16]通過動物實驗探討阿司匹林對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療作用。將40只3月齡SD雌性大鼠隨機(jī)分成5組:對照組(Sham)、去勢組(OVX)及3個阿司匹林治療組(Aspirin)。OVX及Aspirin組采用卵巢切除法去勢,飼養(yǎng)3個月建立骨質(zhì)疏松模型。3個阿司匹林治療組分別為8.93、26.79及80.36 mg/kg(A1、A2及A3),每天灌胃1次，連續(xù)灌胃3個月，Sham組和 OVX 組每天用等量的生理鹽水灌胃3個月。雙能X線吸收骨密度測量儀(DXA)及Micro-CT測量結(jié)果顯示：3個阿司匹林治療組腰4椎體骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均顯著高于OVX組，且與Sham組相近。表明阿司匹林可以有效地促進(jìn)大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨小梁的改建,改善骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)的骨密度。Huang 等[17]通過去勢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合模型，探討阿司匹林對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響。將60只3月齡雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分成去勢組50只，假手術(shù)組5只和空白組5只，構(gòu)建去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型。確認(rèn)模型成功后，將去勢組大鼠全部造成左側(cè)股骨中點骨折，用克氏針?biāo)鑳?nèi)固定。再將制成骨折模型的50只大鼠，隨機(jī)分成A組和B組(每組25只)，A組給予阿司匹林灌胃，33 mg/次，1次/d，B組給予等量生理鹽水。兩組分別于骨折術(shù)后測定骨密度值，然后處死取骨痂，行骨痂組織學(xué)檢查，8、12 w行放射學(xué)觀察。兩組剩余的5只大鼠于12 w時行左股骨生物力學(xué)測定。結(jié)果顯示阿司匹林組各時間點骨密度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.2改善骨組織形態(tài)學(xué)及骨生物力學(xué)：Chen等[16]通過動物實驗也證實阿司匹林可以有效地促進(jìn)大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨小梁的改建，改善骨小梁的三維結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)的骨密度和力學(xué)強(qiáng)度。Huang等[17]實驗結(jié)果顯示，組織學(xué)觀察到HE染色,阿司匹林組軟骨內(nèi)成骨過程較對照組加快；生物力學(xué)測定顯示，術(shù)后12 w，阿司匹林組左側(cè)股骨的三點彎曲載荷高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。從而證明阿司匹林能夠促進(jìn)去勢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合，增加骨質(zhì)的骨密度和生物力學(xué)強(qiáng)度。Yao等[18]觀察阿司匹林對于趨勢大鼠骨質(zhì)疏松的影響，探究不同劑量及不同時期口服阿司匹林對骨質(zhì)疏松的輔助治療作用。取42只6個月齡的雌性Wistar大鼠，隨機(jī)選取6只作為假手術(shù)組(A)，余36只作為去勢組。去勢組分為阿司匹林預(yù)防組：去勢對照組(B)，去勢阿司匹林(8.92 mg/kg)組(C)，去勢阿司匹林(26.75 mg/kg)組(D)和阿司匹林治療組：去勢對照(E)，阿司匹林(8.92 mg/kg)組(F)，阿司匹林組(26.75 mg/kg)組(G)。預(yù)防組于去勢后3 d給予不同劑量阿司匹林灌胃，治療組于去勢后12 w灌胃。對42只大鼠雙側(cè)股骨干進(jìn)行取材，對雙側(cè)股骨干行生物力學(xué)測定。結(jié)果顯示預(yù)防部分與治療部分的去勢對照組較假手術(shù)組、去勢8.92 mg/kg組及去勢26.75 mg/kg的三點彎曲載荷顯著降低(P<0.05)。預(yù)防組與治療組同劑量間比較，預(yù)防組的最大破壞應(yīng)力指標(biāo)高于治療組(P<0.05)。表明早期應(yīng)用阿司匹林能增加去勢大鼠的骨密度,增加骨質(zhì)生物力學(xué)強(qiáng)度。Wang等[19]研究阿司匹林對去勢大鼠腰椎微觀結(jié)構(gòu)的影響。取48只3月齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組：去勢組(OVX組)、對照組(Sham組)及4個阿司匹林治療組(Aspirin組)，每組8只。OVX組及Aspirin組采用卵巢切除法建立骨質(zhì)疏松模型。去勢后1w，阿司匹林治療組劑量分別為2.25、4.46、8.92及26.75 mg/kg(A1、A2、A3及A4組)，每天灌胃1次，OVX組及Sham組予同等量生理鹽水灌胃。灌胃3個月后處死取腰椎椎體，以Micro-CT進(jìn)行測量分析。Micro-CT分析表明：與OVX組比較,阿司匹林各劑量組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨密度(BMD)均顯著性提高(P<0.01)，骨表面積骨體積比(BS/BV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著性降低(P<0.01)，阿司匹林各劑量組BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD與Sham組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。表明阿司匹林可以改善去勢大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)，增加骨質(zhì)密度，對去勢大鼠骨質(zhì)疏松具有防治作用。

2.1.3改善骨代謝生化指標(biāo)：Wang等[20]研究阿司匹林預(yù)防去勢大鼠骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制。實驗動物分組及干預(yù)同文獻(xiàn)[10]，去勢大鼠灌胃3個月后觀察血清骨源性堿性磷酸酶及骨鈣素水平。結(jié)果顯示與OVX組比較，8.92及26.75 mg /kg劑量阿司匹林組骨源性堿性磷酸酶顯著降低(P<0.05)。4.46、8.92及26.75 mg /kg劑量阿司匹林組骨鈣素與Sham組相比顯著升高(P<0.05)。提示阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制可能是通過抑制骨吸收及刺激骨形成發(fā)揮作用。

2.1.4調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)：Yang等[21]探討阿司匹林對去卵巢骨質(zhì)疏松模型鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)表達(dá)的影響，以及其防治骨質(zhì)疏松的作用。選取Sprague-Dawley大鼠60只,隨機(jī)分為對照組(10只)和去卵巢模型組(50只)，術(shù)后1 w去卵巢模型組大鼠再隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松組，其中,A組(0.25 mmol/L阿司匹林)、B組(0.5 mmol/L)、C組(1.0 mmol/L)和D組(1.5 mmol/L),各10只。檢測各組血清和骨組織IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平，同時采用Micro-CT對骨小梁微觀三維形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果骨質(zhì)疏松組血清IL-1、IL-6、TNF-α、M-CSF分別為80.15±7.18、82.16±6.63、30.21±4.73 pg/mL和11.42±4.25 pg/mL，均明顯高于對照組(P<0.05)。A、 B、 C、D組中，D組IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。骨質(zhì)疏松組骨組織IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF分別為71.24±8.10、78.02±5.15、26.92±3.23pg/mL和(10.22±3.15)pg/mL，均明顯高于對照組(P<0.05)；A、B、C、D組中，D組IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。提示阿司匹林能抑制去勢大鼠骨流失，這可能與阿司匹林抑制大鼠血清和骨組織IL-1、IL-6,、TNF-α和M-CSF的表達(dá)有關(guān)，從而使破骨活動減弱的作用。

2.2 離體實驗

2.2.1促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)：Feng等[22]通過體外試驗研究阿司匹林對骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨性分化的影響。培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)，傳代3次后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度阿司匹林(0.5、1、2、5、10 mmol/L)，同時設(shè)立對照組。采用cck-8法分析細(xì)胞增殖情況。比較阿司匹林組與對照組在細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(OC)分泌量、鈣結(jié)節(jié)染色等方面的成骨性差異。結(jié)果顯示阿司匹林無促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，而高濃度阿司匹林能夠強(qiáng)烈抑制細(xì)胞增殖。0.5、1、2 mmol/L濃度阿司匹林可促進(jìn)BMSCs的成骨性分化，中低濃度組堿性磷酸酶含量、骨鈣素分泌量在不同階段顯著高于對照組。14d茜素紅染色可見中低濃度組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量高于對照組。提示中低濃度阿司匹林作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)其成骨細(xì)胞特性表達(dá),表明阿司匹林有促進(jìn)骨代謝合成的作用。

2.2.2抑制破骨細(xì)胞分化成熟：Zhang等[23]研究不同濃度阿司匹林對體外培養(yǎng)大鼠破骨細(xì)胞(Osteoclast, OC)分化成熟及骨吸收活性的影響。建立由核激活因子受體配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor, M-CSF)共同作用的大鼠破骨細(xì)胞骨髓誘導(dǎo)體系，將雌激素(10～6 mmol/L)和不同濃度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)分別作用于破骨細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)后分別對破骨細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色，觀察細(xì)胞形態(tài)并計數(shù)破骨樣細(xì)胞數(shù)量；將各組破骨細(xì)胞接種于骨磨片上，建立破骨細(xì)胞-骨磨片活性分析模型，于不同時間點對骨磨片進(jìn)行光鏡和掃描電鏡觀察，分析計算骨吸收陷窩面積。結(jié)果顯示隨著阿司匹林濃度的增加，阿司匹林組TRAP陽性多核破骨細(xì)胞數(shù)量、骨吸收陷窩面積逐漸減少直至消失。與雌激素組相比，低濃度阿司匹林組(0.25 mmol/L)沒有明顯差異；但中、高濃度阿司匹林實驗組(0.5、1.0、1.5 mmol/L)破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收陷窩面積減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明阿司匹林可抑制破骨細(xì)胞的分化成熟及骨吸收功能，且呈劑量依賴性。

2.2.3抑制破骨細(xì)胞RANK表達(dá)：Zhang等[24]體外試驗研究不同濃度阿司匹林對體外培養(yǎng)大鼠破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)RANK(receptor activator of nuclear factor-κB,核因子κB受體活化因子)表達(dá)的影響。采用RANKL和M-CSF誘導(dǎo)大鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞破骨分化模型,給予不同濃度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)和雌激素(雌二醇10～6 mmol/L)處理，而后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色觀察細(xì)胞形態(tài)特征，掃描電鏡觀察骨磨片破骨細(xì)胞骨吸收陷窩，RT-PCR技術(shù)檢測破骨細(xì)胞表面RANK基因的表達(dá)，ELISA法檢測RANK蛋白的表達(dá)。結(jié)果示阿司匹林和雌激素都可以使大鼠破骨細(xì)胞成熟分化程度和骨吸收活性降低，抑制破骨細(xì)胞RANK基因和蛋白的表達(dá)，且阿司匹林的抑制作用具有劑量依賴性。表明阿司匹林對大鼠破骨細(xì)胞RANK的表達(dá)有抑制作用且呈劑量依賴性，從而抑制破骨細(xì)胞的成熟分化及骨吸收功能。

2.2.4抑制破骨細(xì)胞相關(guān)信號通道：Zeng等[25]通過離體實驗探討阿司匹林對破骨細(xì)胞生成的影響及其分子機(jī)制。體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,以100 ng/mL核激活因子κB(NF-κB)受體配體(RANKL)誘導(dǎo)培養(yǎng)，并同時添加不同溶度的阿司匹林(0、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)培養(yǎng)5d。在不同時間點,通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的方法來觀察破骨細(xì)胞誘導(dǎo)生成能力，用實時熒光PCR方法檢測其破骨細(xì)胞系標(biāo)志基因，包括組織蛋白酶K(CTSK)、TRAP、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和降鈣素受體(CTR)mRNA的表達(dá)。裂解不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞并提取蛋白上樣，行Western印跡檢測NF-κB通道蛋白的表達(dá)以及有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPKS)通道蛋白的表達(dá)，通過免疫熒光的方法分析確定NF-κB的P65的核易位。結(jié)果顯示阿司匹林抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成,隨著阿司匹林濃度增加，破骨細(xì)胞形成數(shù)量明顯減少；其標(biāo)志性基因TRAP、CTSK、MMP9及CTR的mRNA表達(dá)均有所下調(diào)；磷酸化的P65、P50、IKB-a、P38以及氨基端激酶(C-JNK)和胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)蛋白表達(dá)均有所減少，而其非磷酸化的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。阿司匹林同時對NF-KB P65的核易位也表現(xiàn)出抑制效果。表明在RAW264.7細(xì)胞系中,阿司匹林通過抑制NF-κB系統(tǒng)(P65、P50、IKB-a)和MAPKS系統(tǒng)(P38、C-JNK和ERK)通道的激活來抑制破骨細(xì)胞的生成，從而發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松的作用，且在一定范圍內(nèi)和阿司匹林濃度呈正相關(guān)。

3 小結(jié)

大量動物體內(nèi)試驗及離體實驗研究表明，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥療效肯定，主要表現(xiàn)為阿司匹林可提高去勢大鼠骨密度(BMD)值，顯著改善骨組織形態(tài)學(xué)、骨生物力學(xué)、骨代謝生化指標(biāo)、骨代謝密切相關(guān)的細(xì)胞因子水平，影響骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。且阿司匹林治療骨質(zhì)疏松具有雙向良性調(diào)節(jié)作用，既可達(dá)到與外源性雌激素相同的效果，又可避免外源性雌激素過量所出現(xiàn)的副作用[26]。

近年來，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的實驗雖然取得了較大進(jìn)展，但尚存在以下問題：第一，阿司匹林治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理尚未完全闡明，目前已從骨代謝、細(xì)胞因子水平及破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平等方面對其作用機(jī)制做了初步探討，下一步可繼續(xù)從破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞相關(guān)信號通路、基因水平等方面入手進(jìn)行更深入的研究，以揭示阿司匹林促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的效應(yīng)機(jī)制。第二，仍需進(jìn)一步通過流行病學(xué)確定阿司匹林治療骨質(zhì)疏松的劑量多少及療程多長才能達(dá)到有佳療效。從而為阿司匹林這一老藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供更多的研究基礎(chǔ)。