轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

張立蘋林鄭云肖紅衛(wèi)畢延震鄭新民*

（1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

張立蘋1林鄭云2肖紅衛(wèi)1畢延震1鄭新民1*

（1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠克服物種間的生殖隔離、賦予物種新的優(yōu)良性狀，因此動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因豬也將成為豬業(yè)發(fā)展的趨勢，本文將對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種上的應(yīng)用作簡單的介紹，同時(shí)展望其發(fā)展前景。

轉(zhuǎn)基因豬；育種；應(yīng)用

我國豬種資源豐富，地方豬種極多且特征各異，在人們不斷馴化與選育下得到的地方豬種大都具備肉質(zhì)優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)、繁殖力高等特點(diǎn)，但無法克服瘦肉率低、生長速度慢、飼料轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)?，F(xiàn)如今“轉(zhuǎn)基因”已成為了熱門話題，且美國FDA于2015年11月正式批準(zhǔn)了AquaBounty Technologies公司關(guān)于轉(zhuǎn)基因鮭魚上市的申請(qǐng)[1]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)正式開始搬上人們的餐桌。豬肉在我國國內(nèi)市場占有較大比重，以更高效率養(yǎng)殖生豬也是時(shí)下研究的一大熱門。

1 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過基因工程技術(shù)把某一特定基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞里，并通過整合到受體細(xì)胞的基因組中，使該動(dòng)物獲得該基因的遺傳特性，從而改造動(dòng)物品種，獲得人類所需要的特定動(dòng)物的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)的基因交流不同，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)將少數(shù)或個(gè)別基因?qū)胨拗骰蚪M，而且外源基因的來源更加廣泛[2]。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種是指通過轉(zhuǎn)基因的手段，采用基因編輯技術(shù)從分子水平對(duì)動(dòng)物進(jìn)行改良，以期得到具有目標(biāo)性狀的動(dòng)物。1997年，克隆羊Dolly的誕生，開創(chuàng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的先河[3]，2005年，抗乳房炎轉(zhuǎn)基因牛誕生[4]，2006年，多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因克隆豬的培育成功[5]，標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)入了新的發(fā)展歷程。

近年來，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化迅速發(fā)展，已成為當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的支柱性產(chǎn)業(yè)。

2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

豬是與人類生活關(guān)系極為密切的家畜之一，由于豬具有妊娠期短、繁殖力高和后代生長快等特點(diǎn)，因此豬也是常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；又因豬在身體組織部位結(jié)構(gòu)、生理生化等方面均與人類最為接近，所以隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，轉(zhuǎn)基因豬成為不可或缺的研究模型。

2.1 “環(huán)保豬”

豬在生長過程中磷元素是必不可少的，但正常草料中的植物磷難以被豬有效地消化吸收，因此在豬飼料中加入磷元素來保證豬的磷元素?cái)z取量，但是這樣飼養(yǎng)的豬的糞便會(huì)殘留大量的磷元素，如糞便處理不當(dāng)會(huì)造成嚴(yán)重污染。為了解決這一問題，研究人員將大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因通過原核顯微注射導(dǎo)入豬的胚胎，培育出轉(zhuǎn)基因“環(huán)保豬”[6]，“環(huán)保豬”唾液腺分泌的肌醇六磷酸酶能夠有效地消化植物磷，從而不需要在詞料中額外添加磷元素，使糞便中的磷元素含量減少20%～60%，這對(duì)保護(hù)環(huán)境至關(guān)重要。

2.2 提高生長速度

生長激素（Growth Hormone,GH）是一種單鏈肽類激素，可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)以外的所有其他組織生長，因此Hammer[7]和Pursed[8]分別將人和牛的生長激素基因轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)，得到的轉(zhuǎn)基因豬在飼料利用率上提高了約17%，生長速度提高了10%。我國科學(xué)家也將豬生長激素基因轉(zhuǎn)入湖北白豬受精卵中[9]，獲得首批轉(zhuǎn)基因豬，經(jīng)幾個(gè)子代的觀察，生長速度和飼料利用率分別比同窩豬提高13.4%和10%。面對(duì)中國豬肉市場的需求，提高生長速度能夠更好地滿足市場需求，養(yǎng)殖戶也能得得到更多的經(jīng)濟(jì)利益。

2.3 提高瘦肉率

肌肉生長抑制素（MSTN）是一種分泌蛋白，呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)骨骼肌生長的活性因子，直接或間接地控制肌細(xì)胞生長發(fā)育,并能控制肌肉量的增長。當(dāng)其失活的時(shí)候，動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出“雙肌”性狀，在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變的牛、羊等，其中突變牛已被選育成新的肉牛品種，其肉質(zhì)柔軟，脂肪及膽固醇含量低，蛋白質(zhì)含量高，很受到歐洲消費(fèi)者的青睞。但自然選育中，并未發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變的豬，為引入MSTN基因的突變，延邊大學(xué)尹熙俊教授團(tuán)隊(duì)與首爾國立大學(xué)Jin-Soo Kim團(tuán)隊(duì)合作[10]，利用基因編輯技術(shù)將豬內(nèi)肌肉生長抑制素基因敲除，最終得到了雙肌性狀的豬，其瘦肉率顯著提高。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[11]也于2015年成功應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備豬肌肉生長抑制素基因敲除細(xì)胞，并結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)培育出中國首例超級(jí)瘦肉型豬——“中超916”新品系。

2.4 改善肉質(zhì)

據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)ω-6多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,ω-6 PUFAs）與ω-3多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFAs）的比例過高與某些疾病的高發(fā)密切相關(guān)[12]，如糖尿病[13]、冠心病[14]、乳腺癌[15]等；而哺乳動(dòng)物體內(nèi)沒有將ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化成ω-3 PUFAs的酶，因此需要從天然食物中獲取ω-3 PUFAs。Simopoulos[16]的研究指出，目前人類的飲食，ω-6與ω-3的比值過高且有逐年上升的趨勢，而且ω-3 PUFAs來源沒有ω-6 PUFAs豐富，因此膳食中ω-6 PUFAs和ω-3 PUFAs的含量在平衡體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常生長中起著重要作用。2006年，賴良學(xué)等[17]將線蟲的Fat-Ⅰ基因轉(zhuǎn)移到豬細(xì)胞中，最終成功獲得了轉(zhuǎn)fat-Ⅰ基因豬，這種基因編碼的蛋白質(zhì)可將豬自然產(chǎn)生的的ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs。2016年，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[18]制備出優(yōu)化的人源化Fat-1基因，人源化Fat-1基因是按照人類密碼子的偏好對(duì)線蟲Fat-1基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，部分密碼子替換成人類常用的同類編碼子，使改造后的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有更高的表達(dá)效率，并且在構(gòu)建豬細(xì)胞中高效表達(dá)的質(zhì)粒構(gòu)件pMSTN-ω-3時(shí)采用豬骨骼肌肌球蛋白輕鏈基因（Myosin light chain,Mlc）啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，能夠在肌肉細(xì)胞中高效率表達(dá)Fat-1基因，豬肌肉生長抑制素基因（myostatin,MSTN）啟動(dòng)子能夠反向抑制Fat-1基因過量表達(dá)，最后采用原核顯微注射法制備出轉(zhuǎn)hFat-1基因豬。這種轉(zhuǎn)基因豬的組織中有較高含量的ω-3 PUFAs以及較低含量的ω-6 PUFAs，作為一種替代肉源時(shí)，大大提升了豬肉的營養(yǎng)價(jià)值，并且通過采用豬源啟動(dòng)子、增強(qiáng)子調(diào)控基因表達(dá)和無抗生素標(biāo)記基因?qū)?，提高了轉(zhuǎn)基因豬人用食品的安全性。

2.5 加強(qiáng)抗病能力

我國養(yǎng)豬業(yè)主要面對(duì)的兩種病毒性疾病為豬口蹄疫[19]和豬繁殖與呼吸障礙綜合征（藍(lán)耳?。20]，這兩種病毒可以造成大規(guī)模感染，嚴(yán)重制約著我國畜牧業(yè)的發(fā)展。近年來RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)為此類疾病的解決提供了新的途徑。石河子大學(xué)人畜共患病研究團(tuán)隊(duì)[21]2015年成功制備了抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因豬，其研究成果受到國際生命科學(xué)頂尖雜志《eLife》高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為“該研究成果將RNAi技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)結(jié)合，在國際上首次成功制備了靶向FMDV的siRNA轉(zhuǎn)基因克隆豬，證實(shí)轉(zhuǎn)基因克隆豬具有抑制口蹄疫病毒復(fù)制的能力，為口蹄疫的防控提供了新途徑、新方法”。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，羅碧平等[22]在成功構(gòu)建特異性靶向PRRSV基因組的高效表達(dá)shRNA質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,將RNAi與轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)結(jié)合,體外生產(chǎn)豬轉(zhuǎn)shRNA基因克隆胚胎，對(duì)豬藍(lán)耳病也有一定的抗性。這些研究進(jìn)展都為抗病轉(zhuǎn)基因豬打下良好的基礎(chǔ)，且具有良好的應(yīng)用前景。

2.6 器官移植

豬的器官大小、形態(tài)與人相似，可以利用基因修飾豬克服物種間的免疫排斥反應(yīng)作為器官移植的供體器官來源[23]。美國Revivicor公司已經(jīng)制備了敲除α-1,3-半乳糖苷酶基因（Gal）及轉(zhuǎn)入人類基因（CD46）的轉(zhuǎn)基因敲除豬（GalsafeTMpig），這種豬的細(xì)胞免疫原性更接近人類細(xì)胞，免疫排斥反應(yīng)小，為異種動(dòng)物間器官移植的可行性研究奠定了良好基礎(chǔ)。

2.7 生物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因豬作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)主要有乳腺系統(tǒng)和血液系統(tǒng)，美國弗吉尼亞大學(xué)Willam等[24]成功構(gòu)建在乳腺中特異表達(dá)人蛋白C的轉(zhuǎn)基因豬，其表達(dá)量是正常人血含量的200倍。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鄭新民等[25]采用顯微注射法，使含有豬血清白蛋白側(cè)翼序列的微小人血清白蛋白基因?qū)胴i的基因組中，成功制備出轉(zhuǎn)人血清白蛋白（HSA）轉(zhuǎn)基因豬，其血液中表達(dá)量高達(dá)20.3 mg/mL[26]，且豬的血漿蛋白質(zhì)再生速度很快，提取表達(dá)的外源蛋白量將非?？捎^，因此利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)醫(yī)用蛋白潛力十分巨大。

3 展望

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展的今天，轉(zhuǎn)基因技術(shù)愈加成熟可靠，并與新的基因編輯技術(shù)、胚胎克隆、體細(xì)胞克隆等前沿技術(shù)手段緊密結(jié)合起來，在不斷改進(jìn)豬的品種為人們帶來經(jīng)濟(jì)上的利益的同時(shí)，豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、營養(yǎng)代謝、血液生化指標(biāo)值及疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人類極其相似，相比靈長類動(dòng)物沒有倫理道德和動(dòng)物保護(hù)方面的限制，加上成本較低，豬已然成為一種理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，目前廣泛用于消化系統(tǒng)、糖尿病、皮膚科、血液病、新藥評(píng)價(jià)等多個(gè)方面，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的動(dòng)物模型能在分子機(jī)制上模擬疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，比傳統(tǒng)的自發(fā)或誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型更具有優(yōu)勢，可以為人們的各種疾病帶來新的研究途徑，能夠在醫(yī)學(xué)上展現(xiàn)自己的用途。轉(zhuǎn)基因豬作為生物反應(yīng)器，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)賦予豬新的穩(wěn)定遺傳的性狀為人類生產(chǎn)需要的蛋白質(zhì)、藥品原料等，也具有非常好的應(yīng)用前景。

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S813；Q789

A

1673-4645(2017)04-0026-04

2017-01-18

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08006001-005）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（2017-620-004-001）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2016NKYJJ19）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性項(xiàng)目（2016jzxjh013）；湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目（2016ABA117）

張立蘋（1982-），女，河北邢臺(tái)人，主要從事生物技術(shù)研究，E-mail:chzlp1982@163.com

*通訊作者：鄭新民，研究員，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail：anbit20@163.com