溶菌酶脂質(zhì)立方晶凍干粉末的制備及性質(zhì)研究

劉藝寧, 孫艷輝, 王振杰, 劉洪卓

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

溶菌酶脂質(zhì)立方晶凍干粉末的制備及性質(zhì)研究

劉藝寧, 孫艷輝, 王振杰, 劉洪卓*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的通過對脂質(zhì)立方晶凍干粉末性質(zhì)的考察，探索冷凍干燥技術(shù)用于制備脂質(zhì)立方晶粉末的可行性。方法用薄膜分散法制備溶菌酶脂質(zhì)立方晶，經(jīng)冷凍干燥技術(shù)制備立方晶粉末。采用蛋白活性保護(hù)為優(yōu)化指標(biāo)，篩選凍干保護(hù)劑及其用量，確定最優(yōu)處方；測定凍干前后載藥脂質(zhì)立方晶的粒徑、PDI、zeta電位和藥物包封率及活性變化，同時經(jīng)小角光散射和偏光顯微鏡分析凍干前后立方晶結(jié)構(gòu)。以凍干后樣品的休止角和壓縮度評價樣品流動性。結(jié)果以甘露醇為凍干保護(hù)劑，且保護(hù)劑與脂質(zhì)用量質(zhì)量比為5∶1時，載藥脂質(zhì)立方晶凍干前后粒徑、PDI、zeta電位、包封率及活性均沒有明顯變化；小角光散射圖譜和偏光顯微鏡結(jié)果均說明樣品為立方晶結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)立方晶凍干粉末休止角和壓縮度均較大。結(jié)論脂質(zhì)立方晶納米分散物可經(jīng)冷凍干燥進(jìn)行固體化，但凍干后粉體流動性差。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)立方晶；冷凍干燥；溶菌酶；蛋白活性；小角光散射；包封率

立方晶是由兩親性小分子類脂形成的具有脂質(zhì)雙層“蜂窩狀（或海綿狀）”空間結(jié)構(gòu)的聚集體，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和巨大的表面積，賦予了立方晶多樣化的藥物裝載性[1-3]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍最愃幬镙d入立方晶時，藥物保持了其內(nèi)在構(gòu)型和生物活性，提示立方晶作為蛋白藥物載體的應(yīng)用潛能。但是立方液晶相的高黏度、高強(qiáng)度的特性限制了其用作藥物載體的作用方式，為了克服這一限制，人們常常將其制成納米分散物[4-5]。由于脂質(zhì)立方晶納米分散體系物理穩(wěn)定性差、易引起脂質(zhì)材料化學(xué)降解和霉變，影響藥效且液體制劑不利于攜帶、運(yùn)輸、貯存，為其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品帶來極大的障礙[6-7]。

為提高立方晶納米分散物的穩(wěn)定性，本文作者以溶菌酶（lysozyme，LZM）為模型蛋白，采用冷凍干燥技術(shù)制備脂質(zhì)立方晶干燥粉末，并對凍干后脂質(zhì)立方晶的粒徑及分布、zeta電位、包封率、蛋白活性、晶體結(jié)構(gòu)類型和形態(tài)進(jìn)行分析，研究冷凍干燥對制劑性質(zhì)的影響，評價凍干后制劑的粉體學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步的立方晶納米分散物固體化研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司），DZF-6020真空干燥箱、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司），756PC紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），高速離心機(jī)（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司），AUY-120電子天平（日本島津株式會社），Zetasizer ZS90激光粒徑分析儀（英國Malvern公司），BA300Pol偏光顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），LAM-0.5F真空冷凍干燥機(jī)（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），布魯克Nanostar小角散射儀（中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所）。

甘油單油酸酯（glyceryl monooleate，GMO，丹麥Danisco公司饋贈，批號 1141685032），普朗尼克F127（Pluronic F127，德國BASF公司)，溶菌酶（lysozyme，LZM，規(guī)格5 g，德國Merck公司），溶壁微球菌（美國Worthington biochemical公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），Triton X-100（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號 9002-93-1），1,2-丙二醇（PG）、氯仿（分析純，山東省禹王實(shí)業(yè)有限公司），甘露醇（分析純，天津博迪化工股份有限公司），α-乳糖、右旋糖酐（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 脂質(zhì)立方晶納米分散物的制備

采用薄膜分散法制備立方晶納米分散物[8-10]。取GMO 10 mg、F127 1.5 mg 溶于氯仿中，混勻后，50 ℃真空條件下?lián)]去氯仿成膜后，向其內(nèi)加入PG 26.8 mg，55 ℃攪拌下緩慢滴入LZM溶液0.5 mL以水化脂膜，即得LZM脂質(zhì)立方晶納米分散物。采用馬爾文納米激光粒度儀測定納米分散物的粒徑（Z-average）、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和zeta電位。

2.2 立方晶納米分散物中溶菌酶包封率的測定

采用超濾離心法測定制劑中溶菌酶的包封率。取載LZM立方晶納米分散物500 μL，置于超濾離心管（截留分子質(zhì)量為1×106u）中，1×104r·min-1條件下離心10 min后，用BCA法測定濾液中游離LZM濃度，并根據(jù)公式計算藥物的包封率：

其中，m總為加入到立方晶中的藥物總質(zhì)量，m游離為濾液中的藥物質(zhì)量；ρ總為加入體系中藥物的總質(zhì)量濃度，ρ游離為濾液中的藥物質(zhì)量濃度。

2.3 溶菌酶活性的測定

采用比濁法測定LZM的活性[11]。取溶壁微球菌凍干粉10.0 mg，加入pH值6.24 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）適量，在研缽中研磨5 min，倒出后稀釋至50 mL，制成底物溶液，使此懸浮液的A450nm在0.2～0.8內(nèi)。稱取LZM 10.0 mg，溶于pH值7.4的PBS中并定容至10 mL，制成1.0 g·L-1的 LZM 母液。母液經(jīng)適當(dāng)稀釋，配制成質(zhì)量濃度在1～10 mg·L-1內(nèi)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。待測酶液用pH值7.4 PBS將試樣稀釋至適當(dāng)濃度，使其濃度能讓反應(yīng)管每分鐘的 A450nm變化范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線變化范圍內(nèi)。取試管2只，于第一支空白管（B）中加入底物溶液2.5 mL和pH值7.4 PBS 0.5 mL；第二支試管（S）中加入底物溶液2.5 mL，迅速加入標(biāo)準(zhǔn)酶液或待測酶液0.5 mL，立即混勻并計時。每隔半分鐘用紫外分光光度計測定樣品在波長450 nm下吸光度AB和AS，共讀3 min。以A對時間作圖，取反應(yīng)最初的線性部分，計算出每分鐘吸光度的減少值ΔA450nm：

以ΔA450nm對 LZM 濃度作圖得隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品ΔA450nm值計算溶液中的LZM活度。

2.4 載LZM脂質(zhì)立方晶凍干粉末的制備

考察凍干保護(hù)劑乳糖、甘露醇、右旋糖酐對溶菌酶脂質(zhì)立方晶納米分散物冷凍干燥過程中的保護(hù)作用。將各種凍干保護(hù)劑按與脂質(zhì)質(zhì)量比5∶1，溶于制得的載藥立方晶分散物中，完全溶解后，于-40 ℃預(yù)凍4 h，凍干，得載藥立方晶的凍干劑。復(fù)溶后，測定LZM的活性。

考察脂質(zhì)與甘露醇質(zhì)量比分別為1∶2.5、1∶5和1∶7.5對凍干后LZM活性的影響，結(jié)合凍干后制劑的外觀和復(fù)溶情況，確定最優(yōu)處方。最優(yōu)處方經(jīng)復(fù)溶后，測定粒徑及zeta電位，計算LZM包封率[12]。

2.5納米分散顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的表征

采用布魯克 Nanostar小角散射儀測定小角光散射(SAXS)數(shù)據(jù)，以表征納米分散顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。測試條件為：光束的波長為λ=1.54 ?(12.0 keV)，流速為每秒1×1013個光子。在含有10個模塊的Decris-Pilatus的1.84 M探測器上記錄2D衍射圖。測試時，將樣品加入自制的樣品池中后，裝入SAXS儀器室內(nèi)的定制樣品架。每個樣品的曝光時間為6 h。使用fit2D軟件包分析SAXS數(shù)據(jù)。

2.6 晶體形態(tài)的測定

采用BA300Pol偏光顯微鏡觀察加入脂質(zhì)立方晶的甘露醇凍干粉末復(fù)溶后的晶體形態(tài)。

2.7 制劑的粉體學(xué)性質(zhì)研究

2.7.1 休止角的測定

取凍干粉末注入一有限直徑的圓盤中心上，直到粉體堆積層斜邊的物料沿圓盤邊緣自動流出為止，停止注入，測定圓盤上形成錐體的高度，將其與圓盤半徑相比即得休止角的正切值，計算休止角。

2.7.2 壓縮度的測定

取凍干粉末置于改制5 mL量筒，直至其體積讀數(shù)為一特定值V初，輕敲并觀察量筒中粉體的體積變化，直到體積無明顯變化為止，記錄下最終的體積V終。分別稱量加樣前后量筒質(zhì)量，其差值即為所加入粉體的質(zhì)量m。堆密度(bulk density，ρb)、振實(shí)密度(tap density，ρtap)與壓縮度(compressibility，wC)的計算公式如下：ρb= m / V初；ρtap= m / V終；wC= (ρtap- ρb) / ρtap×100%。

3 結(jié)果與討論

3.1 凍干保護(hù)劑及加入量對溶菌酶活性的影響

以LZM活性為評價指標(biāo)，分析不同凍干保護(hù)劑對蛋白活性的影響，結(jié)果見圖1。 結(jié)果表明，各種凍干保護(hù)劑對LZM保護(hù)作用優(yōu)劣順序是甘露醇、右旋糖酐、乳糖。優(yōu)選甘露醇作為本實(shí)驗的凍干保護(hù)劑。

在考察的范圍內(nèi)甘露醇的加入量對LZM的活性無影響 （圖2），但因加入脂質(zhì)與甘露醇比例為1∶5的樣品凍干后制劑無嚴(yán)重塌陷現(xiàn)象，如圖3所示，且復(fù)溶較好，所以選擇脂質(zhì)與甘露醇比例為1∶5作為最終處方。

3.2 粒徑分布及zeta電位

由表1可知，經(jīng)薄膜分散法制備的空白立方晶納米分散物粒徑分布較為均勻，粒徑約為165 nm；載入LZM后，立方晶粒徑明顯增加，且粒子表面zeta電位由-20 mV下降為-3.5 mV，提示藥物可能參與脂質(zhì)立方晶結(jié)構(gòu)的自組裝。在載LZM納米分散物中加入甘露醇后，粒子粒徑有所下降，而凍干后立方晶分散物的粒徑略微增大，約為240 nm，PDI值為0.22，說明凍干處理后制劑復(fù)溶較好。

3.3 包封率的測定

考察凍干對制劑中藥物包封率的影響，由圖4可知，新鮮制備的立方晶納米分散物中藥物的包封率為 (93.4±4.1)%，而凍干后包封率為(92.9±3.6)%，兩組無顯著差異，說明凍干對制劑中藥物包載無影響。

3.4 溶菌酶活性測定

考察凍干對制劑中LZM活性的影響，結(jié)果如圖5所示。新鮮制備的立方晶納米分散物中藥物的活性為(95.8±9.1)% ，凍干后 LZM 活性略有下降，為(91.3±10.4)%，但兩組無顯著差異，說明凍干過程對LZM活性無影響。

3.5 SAXS圖譜

空白立方晶和凍干前后載LZM立方晶的SAXS圖譜如圖6所示。由圖6可見，空白脂質(zhì)立方晶納米分散物與載LZM粒子均呈現(xiàn)出2組散射峰，其峰間距比近似為說明此時樣品為Pn3m和Ia3d型混合立方液晶[13]，但I(xiàn)a3d型散射信號較弱；凍干粉末復(fù)分散后粒子呈現(xiàn)出4個典型散射峰，其峰間距比為，說明該樣品的晶格類型為仍為Pn3m，也屬立方液晶，說明凍干后制劑立方晶結(jié)構(gòu)無顯著變化。

3.6 偏光顯微鏡圖

偏光顯微鏡下觀察樣品的結(jié)果如圖7所示，甘露醇粉末為針狀晶體（圖7A），加入脂質(zhì)立方晶后經(jīng)凍干處理復(fù)分散后未見任何雙折射現(xiàn)象（圖 7B）。由于立方晶具有等向性，所以在偏光顯微鏡下無雙折射現(xiàn)象，進(jìn)一步佐證同步SAXS試驗的結(jié)果[14]，提示甘露醇參與了立方晶自組裝，這可能是加入甘露醇后立方晶納米分散物粒徑改變的根本原因。

3.7 粉體流動性測定

休止角和壓縮度是衡量粉體流動性的主要指標(biāo)，休止角越小，流動性越好，一般認(rèn)為小于 30°的粉體流動性好， 而小于40°的粉體能夠滿足生產(chǎn)過程的要求。壓縮度是密度由最松密度變?yōu)樽罹o密度的減少程度，其值在20%以下的粉體流動性較好，隨著壓縮度增大粉體的流動性下降，當(dāng)壓縮度達(dá)到 40%～50%時粉體將很難從容器中自動流出。實(shí)驗考察了以乳糖、甘露醇、右旋糖苷為凍干保護(hù)劑的凍干粉末的休止角、堆密度、振實(shí)密度、壓縮度，結(jié)果見表 2。選用不同載體的脂質(zhì)立方晶凍干粉末的粉體流動性均較差。

4 結(jié)論

作者通過對脂質(zhì)立方晶凍干粉末理化性質(zhì)的研究，探討了載蛋白類藥物脂質(zhì)立方晶經(jīng)凍干制備固體化的可行性。結(jié)果表明，所得凍干制劑中立方晶結(jié)構(gòu)不變，易復(fù)溶且分散性好，凍干前后藥物的包封率均高于90%，凍干過程對制劑中包載的溶菌酶活性無影響，為工業(yè)生產(chǎn)立方晶納米分散物凍干品提供了參考。但所得的脂質(zhì)立方晶粉體流動性較差，這些問題還有待解決[15]。

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Preparation of lysozyme loaded cubosome freeze-dried power and properties research

Liu Yining, Sun Yanhui, Wang Zhenjie, Liu Hongzhuo*

(School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo explore the feasibility of preparation of cubosomes freeze-dried power using lyophilization technology by investigating the physicochemical properties of cubosome freeze-dried power.MethodsThe lysozyme (LZM) loaded cubsome nanocarriers were prepared by film dispersion method and then dried by lyophilization technology. With the activity of protein as optimizing index, the lyoprotectant and its dosage was chosen for the optimal formulation. The changes in Z-average, PDI, zeta potential, encapsulation efficiency and activity of LZM before and after lyophilization were compared. Structure confirmation were characterized using small angle X-ray scattering (SAXS) and polarized light microscopy, respectively. The flowability of freeze-dried power was evaluated with compressibility and angle of repose.ResultsWith mannitol (the mass ratio with lipid 5∶1) as lyoprotectant, the prepared LZM-loaded cubosomes before and after lyophilization had no obvious changes of Z-average, PDI, zeta potential, encapsulation efficiency, activity. The freeze dried power obtained in the present work indicated the formation of cubic mesophase in the prepared power based on the data from SAXS spectrum and polarized light microscopy. The repose angle and the compressibility of cubosomes freeze-dried power were both high.ConclusionsCubosome nanoparticle can be solidified by lyophilization, however, the flowability of the freeze-dried power is poor.

pharmaceutics; cubosome; lyophilization; lysozyme; protein activity; SAXS; encapsulation efficiency

R94

A

（2017）02–0032–09

10.14146/j.cnki.cjp.2017.02.002

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

2016-05-16

劉藝寧(1987-), 女(滿族), 遼寧沈陽人, 碩士研究生, E-mail eveningliu@126.com; *通訊作者: 劉洪卓(1979-), 女(漢族), 遼寧沈陽人, 副教授, 博士, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事治療藥物性耳聾靶向納米制劑的研究, Tel. 13236637187, E-mail bby_1979@163.com。