丹珍頭痛膠囊微生物限度檢查方法研究

張小莉

（陜西省咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

·檢驗檢測·

丹珍頭痛膠囊微生物限度檢查方法研究

張小莉

（陜西省咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

目的 建立丹珍頭痛膠囊的微生物限度檢查方法。方法 根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的微生物計數(shù)法，通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的控制菌檢查法和通則1107非無菌藥品微生物限度標準進行方法適用性試驗。結果 采用薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)，平皿法－傾注法測定霉菌和酵母菌總數(shù)；控制菌檢查法采用常規(guī)法供試品陽性對照組檢查陽性目標菌。結論 該方法可作為丹珍頭痛膠囊微生物限度的檢查方法。

丹珍頭痛膠囊；微生物限度檢查；方法適用性試驗；薄膜過濾法；平皿法－傾注法

丹珍頭痛膠囊由高原丹參、夏枯草、熟地黃、珍珠母、雞血藤、川芎等12味中藥材組方[1]，有平肝熄風、散瘀通絡、解痙止痛的功效，主要用于治療肝陽上亢、瘀血阻絡所致的頭痛，背痛頸酸，煩躁易怒。2005年版《中國藥典(四部)》中規(guī)定了本產(chǎn)品的微生物限度檢查方法[2]。2015年版《中國藥典（四部）》[3]藥品微生物限度檢查法與歐美標準接軌[4]，相較2010年版[5]變化很大，尤其是微生物限度檢查方法適用性試驗。本研究中根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法（通則1105、通則1106），建立適合該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，對3批產(chǎn)品進行方法適用性試驗，結果表明，該方法有效、可行?，F(xiàn)報道如下。

1 試驗材料

1.1 儀器

AD－1000型電子天平（福州志華科學儀器電子有限公司）；BHC1300IIA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSP－250型生化培養(yǎng)箱（上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；BMJ－250C型霉菌培養(yǎng)箱（上海迅博實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；FC752型一次性薄膜過濾器（浙江泰林生物技術股份有限公司）。

1.2 試藥、培養(yǎng)基與菌種

試藥：丹珍頭痛膠囊（規(guī)格為每粒 0.5 g，批號為20160111，20160313，20160402）。培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為150801），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號為150825），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號為150801），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號為150801），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號為150801），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為151013），RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號為150201），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號為 150507），三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（批號為140519），均購自北京陸橋技術有限責任公司；pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（稀釋劑，批號為141213，北京陸橋技術有限責任公司)；氯化鈉（分析純，批號為20160116，天津科密歐化學試劑有限公司）。

菌種：金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus[CMCC (B)26 003]，銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B)10 104]，枯草芽孢桿菌 Bacillussubtilis[CMCC (B)63 501]，白色念珠菌 Candida albicans[CMCC(F) 98 001]，黑曲霉 Aspergillusniger[CMCC(F)98 003]，大腸埃希菌 Escherichia coli[CMCC(B)44 102]，乙型副傷寒沙門菌 Salmonella paratyphi B[CMCC(B)50 094]，均為第3代，均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

取上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌34℃培養(yǎng)20 h新鮮TSB培養(yǎng)物，白色念珠菌25℃培養(yǎng)2 d新鮮SDB培養(yǎng)物分別用0.9%氯化鈉注射液稀釋至1 000～10 000 cfu／m L；黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上，25℃培養(yǎng)7 d，用0.05%（V∶V）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液洗脫黑曲霉孢子，稀釋成1 000～10 000 cfu／mL的孢子菌懸液（供菌落計數(shù)用）。

上述大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌34℃培養(yǎng)20 h新鮮TSB培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉注射液稀釋至10～100 cfu／mL（供控制菌用）。

2.2 計數(shù)方法適用性試驗

2.2.1 供試品溶液制備

取供試品10 g，加pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，40℃水浴振蕩15min，制備成1∶10的供試品溶液（1）；分別取供試品溶液50，20，10m L加至50，80，90m L稀釋液中，即得1∶20，1∶50，1∶100的系列濃度供試品溶液。

2.2.2 平皿法－傾注法

試驗組[6]：取上述各試驗菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）0.1m L加9.9 mL供試品溶液（1）搖勻，取5組各樣1m L注皿（直徑90mm，下同），每組平行2皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)3 d，進行需氧菌總數(shù)測定；分取后2組樣1mL注皿，每組平行2皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)3 d。進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。分別取金黃色葡萄球菌液0.1m L，加至9.9m L系列濃度供試品溶液，搖勻，同法操作，測定金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)。

供試品對照組：取上述稀釋劑0.1m L，加至9.9m L系列濃度供試品溶液，搖勻，取1mL加皿，操作同試驗組，測定供試品的本底菌數(shù)。

菌液對照組：取上述各試驗菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）0.1mL加至9.9mL稀釋液，依法測定所加菌落數(shù)。

全過程進行陰性對照試驗，陰性對照無菌落生長。結果顯示，濃度1∶10時，金黃色葡萄球菌回收率小于0.5，需氧菌后4組的3次試驗回收率均大于0.5，不可采用平皿法－傾注法（每1皿為1 m L，直徑為90 mm）進行需氧菌總數(shù)測定。霉菌和酵母菌總數(shù)回收率大于0.5，可采用平皿法－傾注法（濃度為1∶10，稀釋液為pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，每1皿為1m L，直徑為90mm）測定霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.2.3 薄膜過濾法[7]

試驗組：取金黃色葡萄球菌液0.1 mL，加至1∶10濃度供試品溶液9.9 m L，搖勻。取樣1 mL注入含有100 m L沖洗液（pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，下同）的薄膜過濾器中（沖洗液潤濕膜后再注入樣），進行薄膜過濾，沖洗量分別為每膜300，500，800 m L，抽干，取出膜貼于胰酪大豆胨瓊脂平板34℃培養(yǎng)2 d，測定需氧菌總數(shù)（金黃色葡萄球菌）。

供試品對照組：取0.1 m L稀釋液加上述1∶10供試品溶液9.9m L，搖勻。取樣1m L注入含有100m L沖洗液的薄膜過濾器中（沖洗液潤濕膜后再注入樣），操作同試驗組，測定供試品的本底菌數(shù)。

菌液組：取金黃色葡萄球菌液0.1mL，加至9.9mL稀釋液，搖勻。取菌液1mL注入含有100mL沖洗液的薄膜過濾器中（沖洗液潤濕膜后再注入菌液），操作同試驗組，測定所加菌落數(shù)。

全過程進行陰性對照試驗，陰性對照無菌落生長。結果顯示沖洗量為每膜800m L，回收率大于0.5。需氧菌總數(shù)用薄膜過濾法（取1∶10的供試品溶液1m L注入含有100mL的薄膜過濾器中，稀釋液為pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，沖洗液同稀釋液，沖洗量為每膜800mL，每次100m L）抽干，取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上。

2.3 控制菌檢查方法適用性

2.3.1 大腸埃希菌

供試品溶液組：取1∶10濃度供試品溶液10m L，加至100m L的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中培養(yǎng)18 h，取TSB培養(yǎng)物1 mL加入100 m L麥康凱液體培養(yǎng)基中，按照2015年版《中國藥典(四部)》通則1106檢查，供試品溶液未檢出菌落。

供試品溶液陽性對照組：取1∶10濃度供試品溶液10 mL，加至 100 m L的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，同時加少于1 m L（含大腸埃希菌10～100 cfu）培養(yǎng)18 h，按供試品溶液組方法操作，經(jīng)鑒定麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板檢出大腸埃希菌。

陰性對照試驗同步。結果顯示，供試品溶液陽性對照組檢出菌落，供試品溶液組、陰性對照組未檢出菌落?？刂凭椒ㄟm用性試驗通過。

2.3.2 沙門菌

供試品溶液組：取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）100m L，40℃水浴振蕩15min，搖勻，即得供試品溶液，34℃培養(yǎng)18 h，取TSB培養(yǎng)物0.1mL，加至10mLRV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，按2015年版《中國藥典(四部)》通則1106檢查，供試品未檢出菌落。

供試品溶液陽性對照組：取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）100 m L，40℃水浴振蕩15 min，即得供試品溶液，同時加入沙門菌少于1m L（含沙門菌10～100 cfu），混勻，34℃培養(yǎng)18 h。同供試品溶液組方法操作，經(jīng)鑒定三糖鐵瓊脂高層斜面檢出沙門菌。

陰性對照試驗同步。結果顯示，供試品溶液陽性對照組檢出菌落，供試品溶液組、陰性對照組未檢出菌落，控制菌方法適用性試驗通過，可用常規(guī)法進行該產(chǎn)品控制菌檢查。

3 討論

3.1 菌落計數(shù)

《中國藥典》規(guī)定選用濃度1∶10，試驗中發(fā)現(xiàn)回收率為0.5～2，小于0.5，不符合這一規(guī)定。選擇稀釋制成1∶20，1∶50，1∶100等不同濃度，且稀釋倍數(shù)不能超過該供試品的微生物限度標準[8]。本產(chǎn)品提取物均不含原藥材粉，需氧菌總數(shù)微生物限度標準1 000，而1∶1 000無實際意義，故選用薄膜過濾法。

3.2 控制菌檢查

一般情況下，控制菌檢查（除沙門菌外）選擇1∶10濃度，取10mL（即1 g），藥典規(guī)定檢出限每1 g（耐膽鹽革蘭陰性菌還有0.01，0.001 g）。如樣品特殊，不易制得1∶10，可制成其他濃度，取總量1 g即可。應注意的是，試驗中按照藥典規(guī)定最短時間培養(yǎng)[9]，現(xiàn)象不明顯可適當延長，但不得超過規(guī)定最長時間?？刂凭栃詫φ湛蛇x擇儀器測定，但首次使用必須與藥典方法進行比對，以確認儀器檢查結果準確。

3.3 稀釋液選擇

2015年版《中國藥典》規(guī)定有①pH＝7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液；②pH＝7.2磷酸鹽緩沖液；③胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等。最常用的是①，有緩沖能力，提供營養(yǎng)，且等滲較③成本低。如供試品含原藥材粉，則選用③較好，因為藥典規(guī)定含原藥材粉應控制菌－耐膽鹽革蘭陰性菌，稀釋液選用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，可以制備1份供試品溶液，菌落計數(shù)和控制菌檢查項目可同時做。腸溶制劑一般選用②，如樣品特別復雜，選用其他溶劑時還應加相應的中和劑或滅活劑消除抑菌作用[10]。

3.4 薄膜過濾法

沖洗液及沖洗液總量選擇常用有①0.1%的蛋白胨溶液；②0.9%氯化鈉溶液；③pH＝7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液等。最常用的是①，其保證營養(yǎng)使得菌落在沖洗過程中不受損，也易配制。本試驗中發(fā)現(xiàn)選③有較強的緩沖能力，沖洗效果好。先每膜300 m L沖洗，回收率小于0.5，加至500 mL，直至800m L進行沖洗，回收率大于0.5。沖洗次數(shù)少，減少細菌受損程度，選300m L可依次增加（總量小于1 000m L）直到回收率大于0.5，否則用雙膜法[11]或含有中和劑的沖洗液。值得注意的是，沖洗前加適量沖洗液潤濕膜后，再加樣混勻沖洗，否則水溶性膜吸附樣品溶液，不易徹底沖洗殘留樣；貼膜用平板可預先制備，冰箱保存，用前放至室溫[12]；選用一次性封閉式薄膜過濾器，簡單易行[13]。

3.5 菌落計數(shù)－霉菌和酵母菌總數(shù)所用培養(yǎng)基選擇

2015年版《中國藥典》規(guī)定，所用是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）。SDA是廣譜霉菌培養(yǎng)基[14]，且藥典規(guī)定計入所生長的細菌總數(shù)。有時藥材粉營養(yǎng)成分在未處理徹底的情況下，霉菌和酵母菌總數(shù)超標?？蛇x用選擇性培養(yǎng)基－玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，如選用含有抗生素的SDA，市場無商品培養(yǎng)基，加抗生素種類和量也不易控制；選用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，但需經(jīng)過試驗確認。

3.6 方法適用性試驗次數(shù)選擇

2010年版《中國藥典》規(guī)定，菌落計數(shù)3次獨立的平行試驗，但2015年版《中國藥典》未規(guī)定試驗次數(shù)，采用2010版的方法和考察方法的可靠性強，一般生產(chǎn)企業(yè)選3個不同批號進行試驗（各1次），對第1次結果進行驗證以考察方法的耐用性?？刂凭鷻z查也同樣做3次試驗。

3.7 培養(yǎng)條件選擇

菌落計數(shù)－霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)中黑曲霉20～25℃一般培養(yǎng)3 d[15]即可，試驗中發(fā)現(xiàn)黑曲霉培養(yǎng)第4天后蔓延成片不好計數(shù)，故霉菌開始生長時應每天觀察、計數(shù)。

[1]WS－10633（ZD－0633）－2002－2012Z.國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：71－72.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：140－151.

[4]楊曉莉，李 輝，馬英英，等.中國藥典2015版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101－1107.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅢC80－附錄ⅩⅢC84.

[6]羅達龍，覃 藍，李夷君，等.鹽酸氨溴索緩釋膠囊微生物限度檢查的方法學驗證[J].臨床醫(yī)藥文獻雜志(電子版)，2016，3（12）：2439－2440.

[7]李 芳，劉冬玲，劉 浩，等.氟羅沙星膠囊微生物限度檢查方法研究[J].中國抗生素雜志，2016，41（6）：445－447.

[8]達朝榮，陳建強 .藥品微生物限度檢查誤差影響因素的分析[J].北方藥學，2016，13（1）：177.

[9]楊曉莉，李 輝，馬英英，等.《中國藥典》2015版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19(4)：748－752.

[10]董 芳，王嘉南，王風平，等.鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法的驗證[J].食品與藥品，2015，17（1）：40－43.

[11]丁 勃，徐曉潔，劉廣楨，等.雙濾膜過濾方法在藥品微生物限度檢查中的應用研究[J].藥物分析雜志，2014，41（6）：2105－2106.

[12]張 穎，安秀華，王建平，等.藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基的滅菌和貯存期驗證[J].中國藥房，2013，24（21）：2002－2004.

[13]劉毅萍，何建平.封閉式薄膜過濾器（一次性）在藥物藥品微生物限度檢查中的應用[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2003，20（1）：68－69.

[14]景榮先，張國林.2015版《中國藥典》微生物限度檢查法潔凈環(huán)境及計數(shù)培養(yǎng)基修訂分析探討[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2015，12（5）：184－185.

[15]國家藥典委員會.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：359.

M icrobial Lim it Test M ethod of Danzhen Toutong Capsules

Zhang Xiaoli
(Xianyang Food and Drug Inspection Center,Xianyang,Shaanxi,China 712000)

Ob jective To establish a microbial limit test method of Danzhen Toutong Capsules.M ethods According to the fourth volume of Chinese Pharmacopoeia(The 2015 edition),general rule 1105:microbial counting method for microbial limit test of non－sterile products,general rule 1106:the control bacteria examination method for microbial limit test of non－sterile products,general rule 1107:the test method for suitability of microbiological limits for non sterile drugs.Results The total number of aerobic bacteria was determined by the membrane－filter method,the total number of molds and yeasts were determined by plate－pour method,the control bacteria were examined by routine method for positive control group.Conclusion The method can be used as the microbial limit test method for Danzhen Toutong Capsules.

Danzhen Toutong Capsules;microbial limit test;operational suitability test;membrane－filter method;plate－pour method

R284.1

A

1006－4931(2017)07－0037－03

2016－11－24；

2017－01－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.011

張小莉，女，大學本科，主管藥師，研究方向為藥品檢驗，（電子信箱）zxl38122885＠163.com。