健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

施利，毛丹，張紹釩，黃建華，劉新義，張英進(jìn)，雷三林，馬進(jìn)安，向大雄，胡春宏，張四方*

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410008，2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙410028）

健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

施利1，毛丹1，張紹釩1，黃建華2，劉新義1，張英進(jìn)1，雷三林1，馬進(jìn)安1，向大雄1，胡春宏1，張四方1*

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410008，2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙410028）

目的探討健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響及可能作用機(jī)制。方法采用水提法制作健脾解毒方提取物，利用超高效液相-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析健脾解毒方的主要成分，MTT法檢測(cè)健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響，Graphpad Prism5軟件計(jì)算IC50值，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，Western Blot技術(shù)檢測(cè)Phospho-mTOR、Phospho-P53和P21的蛋白表達(dá)。結(jié)果健脾解毒方能夠抑制大腸癌細(xì)胞增殖，處理24、48、72 h后四種大腸癌細(xì)胞系的IC50值分別為HCT116（6.894、5.668、3.648 mg/mL）、LoVo（14.65、8.737、7.849 mg/mL）、SW48（8.029、7.026、5.740 mg/mL）及HT29（13.06、9.646、8.448 mg/mL）；健脾解毒方使大腸癌細(xì)胞周期阻滯在G1期；并能夠下調(diào)Phospho-mTOR蛋白表達(dá)（P＜0.05），上調(diào)Phospho-P53和P21蛋白的表達(dá)（P＜0.05）,使大腸癌細(xì)胞周期阻滯在G1期。結(jié)論健脾解毒方可能通過(guò)mTOR-P53-P21途徑抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，這可能是健脾解毒方治療大腸癌的作用機(jī)制之一。

健脾解毒方；大腸癌；細(xì)胞增殖；半抑制濃度；mTOR

健脾解毒方為湖南省首屆老中醫(yī)師承導(dǎo)師朱偉光教授治療大腸癌的有效經(jīng)驗(yàn)方，全方由黃芪、白術(shù)、西洋參、半枝蓮、甘草等11味藥物組成，具有健脾益氣、清熱解毒之功，隨癥加減在臨床上取得了很好療效[1-2]。本研究采用水提法制作健脾解毒方，利用超高效液相-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF/MS）法分析健脾解毒方的主要成分，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot等技術(shù)，探討健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制，為健脾解毒方治療大腸癌的臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液，美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；胎牛血清澳大利亞Ausbian公司產(chǎn)品；噻唑蘭美國(guó)Genview公司產(chǎn)品；BCA Protein Assay Kit試劑盒上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，NP-40裂解液上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；P-mTOR（phospho s2448）、PP53（phospho s15）及P21抗體美國(guó)abcam公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，供定量測(cè)定用，HPLC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；乙腈（色譜純）德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）美國(guó)sigma公司。色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱及生物安全柜為中國(guó)Heal Force公司產(chǎn)品；SDS-PAGE蛋白電泳儀為上海天能公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為中國(guó)Motic公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；美國(guó)Bechman-Coulter流式細(xì)胞儀，美國(guó)UVP-2000圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)PHANTOM 4300圖像掃描儀，ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo G2 QTof四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞和人正常結(jié)直腸粘膜FHC細(xì)胞（均購(gòu)自長(zhǎng)沙艾佳生物技術(shù)有限公司），于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶底達(dá)80%以上時(shí)常規(guī)消化、傳代、凍存。

1.3 健脾解毒方的制備

健脾解毒方藥材由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供，并經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所中藥鑒定研究室謝昭明研究員鑒定。健脾解毒方由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科劉新義博士制備，具體步驟如下：按比例稱取健脾解毒復(fù)方中各組分，浸泡1 h，分別加8倍水和6倍水加熱回流提取，每次2 h，混合后濾過(guò)，真空負(fù)壓旋轉(zhuǎn)濃縮后分瓶密封，折算成生藥為1 g/mL。

1.4 UPLC-Q-TOF/MS法測(cè)定健脾解毒方粗提物中多種有效成分

液相色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm），0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），使用前超聲脫氣，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)；梯度洗脫程序：流動(dòng)相0～2 min，95%A；2～40 min，50%A；40～50 min，0A；50～52 min，0A；0～2 min，5%B；2～40 min，50%B；40～50 min，100% B；50～52 min，100%B；流速：0.4 mL/min，柱溫20℃，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：離子源為點(diǎn)噴霧電離源正離子模式（ESI+）,毛細(xì)管電壓為1.1 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為100℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為800 L/h，碰撞能量低能量為6 V，梯度高能量為20 V，碰撞氣體為氬氣，掃描時(shí)間為0.2 s，質(zhì)譜掃描范圍100～1 200 m/z。

1.5 細(xì)胞生存率檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細(xì)胞和人正常結(jié)直腸粘膜FHC細(xì)胞增殖的影響。分別收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出，加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm處波長(zhǎng)的吸光值（OD值），計(jì)算平均OD值和細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率（Cell Viability）=健脾解毒方各濃度組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，孵育24 h使細(xì)胞同步化（各組細(xì)胞生長(zhǎng)至60%融合）。更換細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分2組，分別為空白對(duì)照組（Con）、健脾解毒方組（JPJD）。繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干預(yù)24 h后，胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，配制細(xì)胞濃度為1×106/mL，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布百分比，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/ M)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，孵育24 h使細(xì)胞同步化（各組細(xì)胞生長(zhǎng)至60%融合）。更換細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分2組，分別為空白對(duì)照組和健脾解毒方組，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干預(yù)48 h后，收集各組細(xì)胞，加入100 μL裂解緩沖液，冰浴放置120 min，期間輕搖振蕩。然后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。應(yīng)用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣50 μg，保持各孔蛋白量平衡，加入SDS緩沖液，煮沸5 min，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，用Tris緩沖鹽溶液稀釋脫脂奶粉為5%濃度封閉液，室溫封閉2 h，再加入P-mTOR、PP53及P21抗體（1∶700）4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)Tris緩沖鹽溶液洗膜3次后，加入相應(yīng)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，Tris緩沖鹽溶液洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄并進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與β-actin的光密度比值表示目的基因在蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Graphpad Prism5軟件計(jì)算IC50值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示，方差齊性時(shí)兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS法檢測(cè)到健脾解毒方提取物中7種主要成分

以2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)復(fù)方中各單味草藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，我們選取了17個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品并配成混標(biāo)。分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 μL，按色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，分別得到供試品圖譜和對(duì)照品圖譜（見(jiàn)圖1）。依照相應(yīng)的保留時(shí)間和相應(yīng)的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，最終鑒定出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ共7個(gè)成分，其詳細(xì)質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照品混合物（A）和健脾解毒方（B）的總離子流圖

表1 健脾解毒方提取物7種成分質(zhì)譜信息

2.2 健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞增殖的影響

將健脾解毒方分別設(shè)置0、0.05、0.5、5、50、500 mg/mL共6個(gè)濃度梯度干預(yù)24、48、72h后，采用MTT法計(jì)算出健脾解毒方各濃度組細(xì)胞生存率值，結(jié)果表明4種大腸癌細(xì)胞系在5～50 mg/mL濃度區(qū)間細(xì)胞生存率值均能達(dá)到50%，見(jiàn)圖2(A)。通過(guò)Graphpad Prism5軟件計(jì)算IC50值，結(jié)果顯示，健脾解毒方干預(yù)24、48、72 h后，四種大腸癌細(xì)胞系的IC50值分別為HCT116（6.894、5.668、3.648 mg/mL）、LoVo（14.65、 8.737、7.849 mg/mL）、SW48（8.029、7.026、5.740 mg/mL）及HT29（13.06、9.646、8.448 mg/mL），提示健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細(xì)胞的增殖抑制作用與時(shí)間有一定相關(guān)性，見(jiàn)表2。采用2倍稀釋法重新設(shè)置0、2.5、5、10、20、40 mg/mL共6個(gè)濃度梯度分別干預(yù)24、48、72 h后，計(jì)算出健脾解毒方各濃度組細(xì)胞生存率值并繪制出各組細(xì)胞生存率的曲線圖，見(jiàn)圖2（B，C和D），提示健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞系HCT116、LoVo、SW48及HT29的增殖抑制作用與濃度相關(guān)。

表2 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)IC50值的影響（±s，mg/mL）

表2 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)IC50值的影響（±s，mg/mL）

注：與24 h組比較，*P＜0.05；與48 h組比較，#P＜0.05。

24 h 48 h 72 h 24 h VS 48 h 24 h VS 72 h 48 h VS 72 h HCT116 6.894±0.542 5.668±0.467* 3.648±0.279*#t=6.476 P=0.032 t=28.313 P=0.001 t=8.542 P=0.014 LoVo 14.65±1.142 8.737±0.68* 7.849±0.61* t=21.375 P=0.002 t=21.972 P=0.002 t=2.377 P=0.142 SW48 8.029±0.709 7.026±0.593 5.740±0.435*#t=4.672 P=0.061 t=15.377 P=0.006 t=7.689 P=0.026 HT29 13.06±0.107 9.646±0.765* 8.448±0.671*#t=13.344 P=0.005 t=20.876 P=0.003 t=6.547 P=0.031

圖2 MTT法檢測(cè)健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞周期的影響

依據(jù)計(jì)算得到的大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞的IC50值結(jié)果，設(shè)定健脾解毒方的干預(yù)濃度分別為HCT116（7 mg/mL）、LoVo（14 mg/mL）、SW48（8 mg/mL）及HT29（13 mg/mL），干預(yù)24 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)健脾解毒方對(duì)各組細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較健脾解毒方組G1期細(xì)胞所占比例明顯上升，S期+G2期細(xì)胞比例顯著下降，其增殖指數(shù)也顯著性降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。這些數(shù)據(jù)提示健脾解毒方能夠抑制大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞DNA合成并使細(xì)胞周期阻滯于G1期，見(jiàn)表3。

表3 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞周期的影響（±s，%，n=3）

表3 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞周期的影響（±s，%，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

t值P值HCT116 LoVo SW48 HT29 G1 S G2 G1 S G2 G1 S G2 G1 S G2 Con 50.81±4.61 27.91±2.1 14.01±1.2 48.15±4.17 28.03±2.34 15.01±1.23 49.12±4.16 28.01±2.52 14.21±1.71 50.08±4.31 26.91±2.1 14.81±1.31 JPJD 71.12±6.21* 16.21±1.35* 8.31±0.81* 68.17±5.76* 18.01±1.54* 9.54±0.78* 69.12±5.38* 17.61±1.17* 9.23±0.81* 67.21±5.52* 19.02±1.65* 9.72±0.79* -21.986 27.020 25.315 -21.809 21.694 21.054 -28.394 13.343 10.210 -16.818 30.369 16.954 0.002 0.001 0.002 0.002 0.002 0.002 0.001 0.006 0.009 0.004 0.001 0.003

2.4 健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞Phospho-mTOR(P-mTOR)、Phospho-P53 (PP53)和P21蛋白表達(dá)的影響

如前所述，同樣設(shè)定健脾解毒方的干預(yù)濃度分別為HCT116（6 mg/mL）、LoVo（9 mg/mL）、SW48（8 mg/mL）及HT29（10 mg/mL），干預(yù)48 h后采用Western Blot法檢測(cè)健脾解毒方對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較健脾解毒方組P-mTOR表達(dá)水平明顯下調(diào)，PP53和P21表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4及圖3。

表4 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞P-mTOR、PP53和P21蛋白表達(dá)的影響（±s%，n=3）

表4 健脾解毒方對(duì)大腸癌細(xì)胞P-mTOR、PP53和P21蛋白表達(dá)的影響（±s%，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

t值P值HCT116 LoVo SW48 HT29 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 Con 1.32±0.16 0.33±0.03 0.26±0.03 1.51±0.17 0.12±0.01 0.21±0.02 1.55±0.16 0.22±0.02 0.21±0.02 1.53±0.16 0.16±0.02 0.12±0.01 JPJD 0.72±0.08* 0.82±0.07* 0.53±0.06* 0.68±0.07* 0.32±0.04* 0.65±0.07* 0.23±0.02* 0.61±0.05* 0.65±0.07* 0.75±0.08* 0.34±0.04* 0.25±0.03* 12.990 -21.218 -5.892 9.714 -11.547 -8.468 16.331 -9.650 -8.468 16.887 -9.000 -5.629 0.006 0.002 0.028 0.010 0.007 0.014 0.004 0.011 0.014 0.003 0.012 0.030

圖3 HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞兩組P-mTOR、PP53及P21蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

大腸癌是癌癥死亡的主要原因之一，大腸癌的治療方法包括手術(shù)、化療、放療及靶向治療等，但是其臨床療效并沒(méi)有得到大的改善，手術(shù)后5年生存率約60%[2]，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶后5年生存率約10%[3]，因此找到新的能提高臨床療效的綜合治療方法一直是大腸癌治療的研究熱點(diǎn)。在我國(guó)，中醫(yī)藥在大腸癌的臨床治療中有著重要地位[4]。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥具有改善臨床癥狀、提高免疫力、結(jié)合放化療增敏減毒、減少?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5]。脾虛氣弱、瘀毒結(jié)聚是大腸癌的主要病因病機(jī)，治以健脾益氣、清熱解毒為法，已成醫(yī)家共識(shí)[6-7]。雖然近年來(lái)關(guān)于中醫(yī)藥治療大腸癌的療效機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究取得較大進(jìn)展[8]，但是基于健脾解毒立法的中醫(yī)有效方劑的具體作用機(jī)制仍不十分清楚。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是PI3K/Akt通路的下游分子。mTOR包括mTORC1和mTORC2兩個(gè)復(fù)合物，其中mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感，對(duì)各種細(xì)胞內(nèi)（能量及應(yīng)激）和細(xì)胞外（營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子及激素）信號(hào)起反應(yīng)，通過(guò)其下游的S6K1和4E-BP1促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的中心環(huán)節(jié)[9]。mTOR通路可調(diào)控與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)增殖、周期調(diào)控、侵襲與轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞的形成等多項(xiàng)細(xì)胞功能[10]。mTOR信號(hào)通路異常與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。mTOR已成為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)，mTOR抑制劑臨床試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出抗腫瘤活性，新的m-TOR抑制劑的臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行中[12-13]。

P53基因?yàn)橐职┗?，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期停滯、凋亡及衰老等途徑起抑制腫瘤的作用[14]。P53基因功能異常與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大約有40%～50%的大腸癌患者P53基因突變[15]。P21是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白(CDKs)家族中重要的調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯的主要蛋白[16]。P53在腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程中通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄P21基因，P21蛋白能抑制CDK磷酸化或Cyclin-CDK的活性使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，從而阻滯細(xì)胞周期從G1期向S期的進(jìn)展[17]。mTOR的活化能夠磷酸化P53蛋白的絲氨酸-15位點(diǎn)的磷酸酶（由α-4亞基和PP2A催化亞基組成）從而抑制P53的活性[18]。腫瘤細(xì)胞中異?；罨膍TOR能夠抑制P53的表達(dá)與活性，促進(jìn)腫瘤異常增殖及腫瘤血管生成，從而使腫瘤細(xì)胞獲得永生性[19]。

健脾解毒方由黃芪、白術(shù)、西洋參、半枝蓮、甘草等11味藥物組成。元代著名醫(yī)學(xué)家劉元素指出黃芪的作用有五：“補(bǔ)諸虛不足，一也；益元?dú)猓?；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，?nèi)托陰疽，為瘡家圣藥，五也”。健脾解毒方以黃芪益氣健脾解毒，白術(shù)健脾益氣利水共為君藥，全方共奏健脾益氣、解毒清熱、利濕消腫之功。我們采用水提法制作健脾解毒方，并利用UPLC-Q-TOF/MS法檢測(cè)到了健脾解毒方中7種有效成分：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪提取物毛蕊異黃酮葡萄糖苷能夠通過(guò)ERβ/miR-17信號(hào)通路促進(jìn)大腸癌細(xì)胞凋亡[20]，黃芪甲苷具有增強(qiáng)免疫、抑制肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[21]。西洋參提取物人參皂苷可通過(guò)多種途徑促進(jìn)大腸癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展[22-23]，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能夠誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞周期G1期停滯及細(xì)胞凋亡[24]，半枝蓮提取物芹菜素具有誘導(dǎo)大腸癌HCT116細(xì)胞凋亡及促進(jìn)自噬的作用[25]，甘草提取物甘草酸可通過(guò)下調(diào)HSP90基因表達(dá)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。

本文通過(guò)MTT法檢測(cè)健脾解毒方對(duì)大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，健脾解毒方對(duì)4種大腸癌細(xì)胞系均有抑制增殖的作用，其抑制效率與濃度呈正相關(guān)。我們同時(shí)運(yùn)用Graphpad Prism5軟件計(jì)算健脾解毒方干預(yù)24、48 h及72 h后的IC50值，結(jié)果提示，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)IC50值下降，其抑制作用增強(qiáng)。說(shuō)明健脾解毒方的抑制作用與濃度相關(guān)并有時(shí)間依賴性。健脾解毒方粗提取物對(duì)人正常結(jié)直腸粘膜FHC細(xì)胞增殖沒(méi)有影響（數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示），說(shuō)明其抑制增殖的作用具有針對(duì)大腸癌細(xì)胞的特點(diǎn)而對(duì)正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞沒(méi)有毒性。

為了進(jìn)一步明確健脾解毒方抑制大腸癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健脾解毒方能使大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細(xì)胞周期停滯于G1期?；趍TOR-P53-P21通路在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，通過(guò)檢測(cè)P-mTOR、PP53和P21蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健脾解毒方能夠下調(diào)P-mTOR蛋白表達(dá)，上調(diào)PP53和P21蛋白表達(dá)，提示健脾解毒方可能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mTOR的活化，進(jìn)而促進(jìn)P53的活化，進(jìn)一步活化轉(zhuǎn)錄P21基因，促使大腸癌細(xì)胞G1期停滯。

綜上所述，健脾解毒方具有抑制大腸癌細(xì)胞增殖的作用，其抑制作用與濃度及時(shí)間相關(guān)，健脾解毒方可能通過(guò)mTOR-P53-P21信號(hào)途徑抑制大腸癌細(xì)胞增殖，這可能是健脾解毒方治療大腸癌的作用機(jī)制之一。

[1]張四方，朱偉光，何明大，等.中藥干預(yù)對(duì)結(jié)腸癌化療患者生活質(zhì)量和負(fù)性情緒影響的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國(guó)臨床心理學(xué)雜志，2007，4（4）:125-130.

[2]Lin FX,Tian LF,Lei CY,et al.Chinese medicine for outcomes in colorectal cancer patients:A retrospective clinical study[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine,2016,7:1-6.

[3]Storli KE,Sondenaa K,Bukholm IR,et al.Overall survival after resection for colon cancer in a national cohort study was adversely affected by TNM stage,lymph node ratio,gender,and old age[J].Int J Colorectal Dis,2011,26(10):1299-1307.

[4]Davies JM,Goldberg RM.Treatment of metastatic colorectal cancer[J].Semin Oncol,2011,38(4):552-560.

[5]白建平，張海波，李勇，等.中西醫(yī)結(jié)合治療大腸癌思路與方法探討[J].陜西中醫(yī)，2011，32(3):303-304.

[6]Deng S,Hu B,An HM.Traditional Chinese Medicinal Syndromes and Treatment in Colorectal Cancer[J].J Cancer Ther, 2012,3(6):888-897.

[7]張藝梁，葉麗紅.大腸癌中醫(yī)研究近況[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（4）:216-219.

[8]劉宣，范忠澤，李琦.中醫(yī)藥治療大腸癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(6):1808-1811.

[9]Fingar DC,Salama S,Tsou C,et al.Mammalian cell size is controlledbymTORanditsdownstreamtargetsS6K1and 4EBP1/eIF4E[J].Genes Dev,2002,16(12):1472-1487.

[10]Asati V,Mahapatra DK,Bharti SK.PI3K/Akt/mTOR and Ras/ Raf/MEK/ERK signaling pathways inhibitors as anticancer agents:Structural and pharmacological perspectives[J].Eur J Med Chem,2016,109:314-341.

[11]Slattery ML,Herrick JS,Lundgreen A,et al.Genetic variation in a metabolic signaling pathway and colon and rectal cancer risk:mTOR,PTEN,STK11,RPKAA1,PRKAG2,TSC1,TSC2, PI3K and Akt1[J].Carcinogenesis,2010,31(9):1604-1611.

[12]Battelli C,Cho D C.mTOR inhibitors in renal cell carcinoma [J].Therapy,2011,8(4):359-367.

[13]LiuL,ZhangW,LiW,etal.AphaseIstudyof ridaforolimus in adult Chinese patients with advanced solid tumors[J].J Hematol Oncol,2013,6:48.

[14]Levine A J,Finlay C A,Hinds P W.P53 is a tumor suppressor gene[J].Cell,2004,116(2 Suppl):453-456.

[15]Takayama T,Miyanishi K,Hayashi T,et al.Colorectal cancer:genetics of development and metastasis[J].J Gastroenterol, 2006,41(3):185-192.

[16]Abbas T,Dutta A.p21 in cancer:intricate networks and multiple activities[J].Nature Reviews Cancer,2009,9(6):400-414.

[17]Liu SX,Bishop WR,Liu M.Differential effects of cell cycle regulatory protein p21WAF1/Cip1 on apoptosis and sensitivity to cancer chemotherapy[J].Drug Resistance Updates,2003,6(4):183-195.

[18]Longerich T.EEF1A2 inhibits the p53 function inhepatocellular carcinomaviaPI3K/AKT/mTOR-dependentstabilizationof MDM4[J].Pathologe,2014,35（Suppl 2）:177-184.

[19]Kong M,Fox C J,Mu J,et al.The PP2A-associated protein alpha4 is an essential inhibitor of apoptosis[J].Science,2004, 306(5696):695-698.

[20]Chen J,Zhao X,Li X,et al.Calycosin induces apoptosis by the regulation of ERβ/miR-17 signaling pathway in human colorectal cancer cells[J].Food Funct,2015,6(9):3091-3097.

[21]ChengX,GuJ,ZhangM,etal.AstragalosideIVinhibits migration and invasion in human lungcancer A549 cells via regulating PKC-α-ERK1/2-NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol,2014,23(1):304-313.

[22]Gum SI,Rahman MK,Won JS,et al.Ginsenoside?Products Triggers Mitochondria/FasL-mediated Apoptosis in Colon Cancer Cells[J].Phytother Res,2016,30(1):136-43.

[23]Junmin S,Hongxiang L,Zhen L,et al.Ginsenoside Rg3 inhibits colon cancer cell migration by suppressing nuclear factor kappa B activity[J].J Tradit Chin Med,2015,35(4):440-444.

[24]Ye Y,Wang H,Chu JH,et al.Atractylenolide?II induces G1 cell-cycle arrest and apoptosis in B16 melanoma cells[J].J Ethnopharmacol,2011,136(1):279-282.

[25]Lee Y,Sung B,Kang YJ,et al.Apigenin-induced apoptosis is enhanced by inhibition of autophagy formation in HCT116 human colon cancercells[J].Int J Oncol,2014,44(5):1599-1606.

[26]Nourazarian SM1,Nourazarian A,Majidinia M,et al.Effect of Root Extracts of Medicinal Herb Glycyrrhiza glabra on HSP90 Gene Expression and Apoptosis in the HT-29 Colon Cancer Cell Line[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(18):8563-8566.

（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Jianpi Jiedu Formula on the Expressions of Proteins Related to mTOR Signal Pathway in Colon Cancer Cell Line

SHI Li1,MAO Dan1,ZHANG Shaofan1,HUANG Jianhua2,LIU Xinyi1,ZHANG Yinjin1,LEI Sanlin1, MA Jin'an1,XIANG Daxiong1,HU Chunhong1,ZHANG Sifang1*
(1.The Second Hospital of Xiangya,Central South University,Changsha,Hunan 410011,China；
2.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410028,China）

ObjectiveTo investigate the effects of Jianpi Jiedu Formula(JPJD)on inhibiting colon cancer cell proliferation capacity and its possible mechanism.MethodsThe main components of water extract of JPJD were analyzed by UPLC-Q-TOF/MS.The effect of JPJD on colon cancer cell proliferation capacity was determined by MTT assays.The IC50value concentration were calculated by Graphpad Prism5 software.The cell cycle was detected by Flow cytometric method.The protein levels of Phospho-mTOR(P-mTOR),Phospho-P53(PP53)and P21 were examined by Western Blot.ResultsMTT assays demonstrated that JPJD can inhibite the colon cancer cell proliferation capacity.The IC50value concentration of JPJDat24h,48hand72haftertreatmentwere6.894,5.668,3.648mg/mLinHCT116cell,14.650,8.737, 7.849 mg/mL in LoVo cell,8.029,7.029,5.740 mg/mL in SW48 cell and 13.06,9.646,8.448 mg/mL in HT29 cell,respectively.JPJD could down-regulate the expression of Phospho-mTOR protein,up-regulate the expression of Phospho-P53 and P21 protein,and keep the cycle of the large intestine cancer cells at G1 phase.ConclusionThe JPJD could inhibit HCT116,LoVo,SW48 and HT29 cells proliferation capacity by mTOR-P53-P21 signaling pathways,and it may be the probable mechanism of JPJD on colorectal cancer.

Jianpi Jiedu Formula;colon cancer;cell proliferation;IC50;mTOR

R285.5；R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.003

2016-09-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273722）。

施利，女，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合惡性腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

*張四方，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:m13308439612@163.com。