免疫性血小板減少癥病證結(jié)合動物模型研究

郎海燕，褚雨霆，馬薇 ，張雅月 ，陳信義*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

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模 型 研 討

免疫性血小板減少癥病證結(jié)合動物模型研究

郎海燕1，褚雨霆2，馬薇2，張雅月2，陳信義2*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

目的：探討非附加條件建立免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic purpura, ITP)病證結(jié)合動物模型的可行性。方法：對3批ITP模型小鼠相關(guān)數(shù)據(jù)進行了綜合分析,并按照病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)，評估注射APS的被動性免疫造模法復(fù)制的小鼠模型是否能夠模擬人類ITP發(fā)病過程與臨床特征。結(jié)果：注射APS復(fù)制的ITP模型小鼠特征如下：1)模型小鼠外周血小板計數(shù)下降、凝血時間延長，與正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2)骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少，與正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.001)。3)模型小鼠注射APS部位或其他部位有自發(fā)性出血。4)造模1周后模型小鼠即有活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發(fā)性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。結(jié)論：在非附加任何條件下，注射APS的被動免疫造模法復(fù)制的ITP動物模型符合病證結(jié)合模型特征，從而為開展中藥藥理學(xué)實驗提供了理想的研究工具。

免疫性血小板減少癥；脾(氣虛)不統(tǒng)血證；病證結(jié)合動物模型

目前，病證結(jié)合是中醫(yī)臨床重要的診療模式，其特點是既注重對疾病的診斷與治療，又重視對中醫(yī)證候的辨證施治[1]。在中醫(yī)研究領(lǐng)域，在研究一組中藥能否用于治療疾病，或要探討臨床療效很好的一組作用機理時，需要建立相應(yīng)的動物模型予以證實。但由于在動物實驗中不能充分運用中醫(yī)四診理論(缺少問診、切診與舌診)，復(fù)制的動物模型多為疾病模型，而缺乏中醫(yī)證候表征[2]。為解決這一難題，通常在慢性疾病基礎(chǔ)上，研究者需要施加其他干預(yù)方法建立一個病加證或證加病的動物模型。這種模型與疾病發(fā)生、進展之間有一些差距。就此，我們提出了“既然能夠復(fù)制疾病模型，就可以通過模型小鼠的某些外在表征觀察，找到與人類疾病相似的中醫(yī)證候特征”[3]?；谶@一假設(shè)，我們對3批非附加任何干預(yù)條件復(fù)制的ITP小鼠模型的相關(guān)數(shù)據(jù)進行了綜合分析，并按照擬定的ITP病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)，評估注射APS的被動性免疫造模法復(fù)制的ITP小鼠模型是否能模擬人類ITP發(fā)病過程與臨床特征。

1 病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)

1.1 疾病模型辨識標(biāo)準(zhǔn)

具備以下4條可判定符合疾病模型標(biāo)準(zhǔn)：1)外周血血小板計數(shù)下降；2)注射或其他部位出血或自發(fā)性皮膚瘀斑；3)凝血時間延長；4)骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少。

1.2 證候模型辨識標(biāo)準(zhǔn)

基于人類ITP發(fā)病特點，結(jié)合實驗小鼠行為學(xué)特征和部分定量檢測指標(biāo)，將用于人體的“氣不攝血證”外在表現(xiàn)轉(zhuǎn)換為類似實驗動物的“脾不統(tǒng)血證”行為學(xué)表征，轉(zhuǎn)換指標(biāo)包括：1)注射或其他部位出血或自發(fā)性皮膚瘀斑為病與證共性特征；2)活動減少類似于神疲乏力；3)行動遲緩類似于肢體倦怠；4)不思飲食、進食與飲水量減少、大便溏稀類似于脾虛或脾氣虛；5)體質(zhì)量下降類似于脾虛，不主肌肉。

1.3 病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)疾病與證候模型辨識指標(biāo)，具備疾病模型辨識標(biāo)準(zhǔn)4條中的3條以上(第1必備)，結(jié)合證候模型辨識標(biāo)準(zhǔn)5條中任意3條，即可判定為病證結(jié)合模型。

2 實驗方法

2.1 抗小鼠血小板血清制備

抗小鼠血小板血清制備步驟：1)取BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，從小鼠心臟取全血，以EDTA-Na2抗凝，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋。2)取已分離的血小板分別與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑混合成油包水狀作抗原，以含完全福氏佐劑抗原于0周注射豚鼠足掌、背及皮下，至少四點；以含不完全福氏佐劑抗原分別于l、2、4周按上述相同部位與點數(shù)注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，560 g×10 min離心后取上清，即得豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，并貯存于-20℃冰箱待用。3)參照ELISA法加以改進，用國產(chǎn)凍干酶聯(lián)A蛋白純品代替堿性磷酸酶-蛋白A酶標(biāo)抗體檢測抗血清效價。4)將APS從-20℃中取出，置56℃水浴30 min，用等量BALB/c小鼠紅細胞吸附至少兩次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度APS備用。

2.2 實驗動物分組

每批實驗動物均采用SPF級健康BALB/c小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，8周齡，雌雄各半。每批實驗前從24只小鼠尾靜脈取血，用全自動血細胞計數(shù)儀檢測小鼠外周血小板計數(shù)后，隨機分2組，每組12只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)；模型組于1、3、5、7、9、11、13天，按照100 μl/20 g劑量向小鼠腹腔內(nèi)注入1∶4稀釋的APS造模，并在動態(tài)觀察各項指標(biāo)變化，于第15天處死小鼠，取骨髓涂片檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)如下：1)疾病模型指標(biāo)：血小板計數(shù)、出血情況、凝血時間、骨髓巨核細胞分類。2)證候模型指標(biāo)：動態(tài)觀察模型小鼠行為學(xué)與體質(zhì)量變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 疾病模型指標(biāo)變化

3.1.1 血小板計數(shù)

實驗結(jié)束后，從尾靜脈取血80 μl，加入帶有EDTA-Na2固體抗凝劑試管,使血液與抗凝劑充分混合后，用全自動血細胞計數(shù)儀檢測血小板計數(shù)。3批實驗結(jié)果見表1。從表1可以看出，造模成功后，模型小鼠外周血血小板數(shù)值明顯下降，與同批實驗正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

組別第1批(n)第2批(n)第3批(n)正常組967.00±301.30(12)542.80±116.13(10)552.00±114.00(9)對照組618.1±192.10*(11)313.60±77.69*(10)314.00±78.00*(10)

注：與正常組比較，*P<0.01。

3.1.2 出血情況比較

在實驗過程中，經(jīng)連續(xù)、動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，注射APS后第3天皮下可見密集的鮮紅出血點，皮下瘀斑融合成片，持續(xù)時間大約3～4天。于造模1周后出血逐漸減輕，出血顏色也由鮮紅逐漸轉(zhuǎn)為暗紅，類似人類ITP慢性出血表現(xiàn)。3批實驗?zāi)Ｐ托∈蟪鲅闆r分別見圖1～3。

圖1 第1批實驗：模型小鼠腹部、四肢出血

圖2 第2批實驗：模型小鼠耳緣出血

圖3 第3批實驗：模型小鼠足趾出血腫脹

3.1.3 凝血時間比較

實驗結(jié)束時取一小滴眼球血于表面皿中，用注射器針頭尖端不斷挑撥，記錄到出現(xiàn)血絲為止的時間(秒)。3批實驗?zāi)獣r間檢測結(jié)果見表2。從表2可以看出，實驗結(jié)束后，模型小鼠凝血時間延長，與同批實驗正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

組別第1批(n)第2批(n)第3批(n)正常組62.66±6.71(12)61.60±2.88(10)61.60±2.88(10)對照組90.81±8.70*(11)81.90±4.12*(10)81.90±4.12*(10)

注：與正常組比較，*P<0.01。

3.1.4 骨髓巨核細胞分類變化

實驗結(jié)束后處死動物，剝離小鼠，取胸骨骨髓，用25 μl小牛血清混勻，迅速涂片，風(fēng)干后做瑞氏染色，用顯微鏡(10×100) 順序計數(shù)100個巨核細胞并分類(原始巨、幼稚巨、顆粒巨、產(chǎn)板巨、裸巨)。3批實驗結(jié)果見表3。從表3結(jié)果可以看出，與同批實驗正常組比，1)模型小鼠骨髓產(chǎn)板巨核細胞明顯減少(P<0.01)；2)第2、第3批實驗?zāi)Ｐ托∈蠊撬杪愫思毎邢陆?P<0.01)。

實驗批次組別(n)原、幼稚巨裸核巨顆粒巨產(chǎn)板巨第1批正常組(12)6.25±1.4827.41±5.0558.16±5.028.16±2.25模型組(11)4.18±1.33△30.63±4.5060.00±3.665.18±1.83*第2批正常組(10)28.90±5.226.30±2.4556.80±5.778.10±1.85模型組(10)32.20±5.903.70±1.42△58.9±5.495.20±1.48▲第3批正常組(10)28.90±5.226.30±2.4556.80±5.778.10±1.85模型組(10)32.20±5.903.70±1.42△58.90±5.495.20±1.48△

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01,▲P<0.001。

3.2 證候模型觀察

3.2.1 小鼠行為學(xué)變化

正常組小鼠在飼養(yǎng)過程中始終反應(yīng)靈活，毛色光潤，喜活動，主動覓食，大便呈條狀。模型小鼠于注射APS后1周表現(xiàn)活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發(fā)性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。

3.2.2 體質(zhì)量比較

3批實驗?zāi)Ｐ托∈篌w質(zhì)量檢測結(jié)果見表4。從表4可以看出，第1、2、3批實驗造模后1周兩組小鼠體質(zhì)量變化不大，造模后2周，模型小鼠體質(zhì)量明顯減輕，與正常組、造模前比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實驗批次分組(n)造模前造模后1周造模后2周第1批正常組(12)18.63±2.3318.95±1.1421.17±1.81模型組(11)20.21±1.5117.69±1.5217.18±1.94*第2批正常組(10)20.10±0.7421.30±0.8221.80±0.79模型組(10)20.00±0.8219.50±0.6718.70±0.95*第3批正常組(20)24.3±2.5223.35±2.1621.00±1.38對照組(20)23.93±2.6622.07±1.6420.65±1.35*

注：與正常組、造模前比較，*P<0.05。

3.3 病證結(jié)合模型判定

基于以上實驗結(jié)果，依據(jù)擬定的ITP病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)判定，ITP模型小鼠除有明顯的注射部位和皮膚自發(fā)性出血、外周血小板數(shù)值下降、凝血時間延長、骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少疾病模型特征外，還具有模型小鼠活動減少、行動遲緩、不思飲食、大便溏稀、毛失光澤、皮膚瘀斑(出血)、體質(zhì)量減輕等外在證候表征。

4 討論

按照疾病急緩程度，將免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenic purpura，ITP)分為急性ITP(Acute immune thrombocytopenic purpura，AITP)與慢性ITP(Chronic immune thrombocytopenic purpura，CITP)兩種類型[4]。基于中醫(yī)理論，結(jié)合臨床表現(xiàn)，AITP多見于兒童，因其發(fā)病急、血小板嚴(yán)重降低、出血量大等，屬中醫(yī)“血熱妄行”證候；CITP特征表現(xiàn)為起病緩慢、病程漫長、血小板減少伴有慢性出血，屬中醫(yī)“氣不攝血”證候[5-6]。通過長期臨床實踐，中醫(yī)藥在治療CITP方面具有明顯的治療優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在中藥能夠改善患者臨床癥狀，緩解出血傾向，提升外周血小板計數(shù)[7-8]。但中醫(yī)藥治療ITP的臨床實際中，我們要證實按照中醫(yī)理論擬定的一組中藥應(yīng)用于臨床是否有效，或說明一組臨床有效的中藥治療ITP作用機制時，需要建立能夠模擬人類ITP發(fā)病過程與臨床特征，且穩(wěn)定性好、可重復(fù)的動物模型。但從目前已經(jīng)發(fā)表的文獻分析，僅有ITP疾病模型，缺乏既符合疾病特點，又符合證候表現(xiàn)的病證結(jié)合模型[9-10]。有基于此，我們擬定了ITP病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)，并試圖通過以被動性免疫造模法復(fù)制的3批ITP動物模型相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析與總結(jié)，判定是否與人類ITP發(fā)病特點及其證候具有一致性，從而為臨床應(yīng)用中醫(yī)的健脾益氣攝血法則治療ITP提供參考。

對3批實驗結(jié)果分析顯示：注射APS復(fù)制的ITP模型小鼠具有下列特征：1)模型小鼠外周血小板計數(shù)下降、凝血時間延長，與正常組比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2)骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少，與正常組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.001)。3)模型小鼠注射APS部位或其他部位均有自發(fā)性出血。4)造模1周后模型小鼠即有活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發(fā)性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。按照預(yù)先擬定的ITP病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)判定，注射APS的被動免疫造模法復(fù)制的ITP模型小鼠具有與人類ITP發(fā)病相似的疾病與證候特征。

以注射APS的被動性免疫造模法復(fù)制ITP動物模型具有技術(shù)成熟度高、操作簡便、重復(fù)性好、干擾因素少、成本相對較低等優(yōu)勢[11-12]。但非附加條件建立ITP病證結(jié)合動物模型研究至今還在探索之中。我們既往也嘗試過不施加任何人為干預(yù)方法，建立免疫性血小板減少性紫癜“氣虛血瘀”病證結(jié)合動物模型，但因血瘀指標(biāo)選擇難度較大，血瘀證據(jù)相對不足，其準(zhǔn)確度還在進一步評估[13]。在本文中除擬定了ITP小鼠疾病模型辨識指標(biāo)外，還擬定了ITP模型小鼠證候辨識標(biāo)準(zhǔn)與轉(zhuǎn)換指標(biāo)，并按照病證結(jié)合模型辨識標(biāo)準(zhǔn)對各項數(shù)據(jù)進行歸納與分析證明，注射APS的被動免疫造模法復(fù)制的ITP模型小鼠檢測的客觀指標(biāo)不但與人類ITP發(fā)病特點一致，其外在表征(中醫(yī)證候)也與人類ITP有高度的相關(guān)性。證明了“非附加條件可以復(fù)制與人類ITP發(fā)病相似的病證結(jié)合動物模型”。同時，通過分析在實驗過程中連續(xù)、動態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射APS后第3天模型小鼠皮下和注射部位可見密集的鮮紅色出血點，皮下瘀斑融合成片，持續(xù)大約3～4天后，出血顏色逐漸轉(zhuǎn)為淡紅或暗紅。在這一暫短的變化過程中，模型小鼠依然存在著明顯活動減少、行動遲緩、不思飲食、食(飲水)量減少、體質(zhì)量下降等表征，我們無法用“血熱妄行證候”來合理解釋，有待通過實驗進一步觀察和總結(jié)。

對于上述結(jié)果與結(jié)論也存在一些需要商榷與改進的問題：1)目前尚無公認(rèn)的ITP病證結(jié)合動物模型辨識標(biāo)準(zhǔn)，我們擬定的證候診斷條件是否確切，有待進一步改進與完善。2)APS屬外源性抗體，并非來源于研究對象自身。當(dāng)停止注射APS后，模型小鼠外周血小板低水平維持時間較短，是否為預(yù)防用藥的最佳動物模型[14]，需待進一步證實。3)雖然本文檢測的各項指標(biāo)均有陽性結(jié)果，如外周血小板數(shù)值下降、骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少、不同程度出血以及具有與人類ITP發(fā)病相似的臨床證候表現(xiàn)。但其他造模方法是否也具有上述特征需要提供更多的實驗證據(jù)[15-16]。4)作為最有說服力的抗血小板抗體、血小板膜糖蛋白(Ⅱa與Ⅲb)在該模型中是否有表達以及該指標(biāo)檢測意義，待通過研究予以證實。因此，在今后的研究中，將用較大的動物(豚鼠或家兔)復(fù)制ITP動物模型，以保證有足夠的血液標(biāo)本用于指標(biāo)檢測。

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Disease-syndrome Combined Animal Models for Immune Thrombocytopenic Purpura

LANG Hai-yan1, CHU Yu-ting2, MA Wei2, ZHANG Ya-yue2, CHEN Xin-yi2*

(1.DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China;2.DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China

To explore the feasibility of establishing the disease-syndrome combined animal models for immune thrombocytopenic purpura (ITP) without additional conditions. Methods: Three batches of data related to the ITP model mice obtained by replication at different time were overall analyzed, and whether the APS-injected model mice replicated through the passive immune modeling method could simulate the pathogenesis and clinical characteristics of human ITP was evaluated according to the differentiation criteria for disease-syndrome combined models. Results: The APS-injected replicated ITP model mice possessed the following characteristics: ①Compared with the normal group, the platelet count was significantly decreased, and coagulation time was significantly increased in the model group (P<0.01). ②Compared with the normal group, the medullary thrombocytogenous megakaryocytes were significantly decreased (P<0.05, 0.01, 0.001). ③The APS injected sites and other parts of model mice had spontaneous hemorrhage. ④Behavioral changing signs were observed after 1 week of modeling,with low activity, delayed activity, poor appetite, skin petechia/hemorrhage and spontaneous hemorrhage of injected sites and other parts, and became more and more severe. Conclusion: According to the syndrome differentiation criteria for disease-syndrome combined models of ITP, the APS-injected animal models of ITP replicated through the passive immune modeling method without additional conditions possess the characteristics of disease-syndrome combined models. It provides an ideal tool for the development of pharmacology experiment in traditional Chinese medicine.

Immune thrombocytopenic purpura; Syndrome of spleen failing to manage blood due to the spleen Qi deficiency; Disease-syndrome combined animal models

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2013CB531705)

郎海燕(1979-)，女，博士，講師，副主任醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療血小板疾病應(yīng)用研究。

陳信義*(1954-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病。

2016-04-28

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0039-05

修回日期：2016-05-10