維生素D及其代謝產(chǎn)物水平測定研究的進展Δ

耿春梅，江 沛，郭玉金

(濟寧市第一人民醫(yī)院臨床藥學科，山東 濟寧 272011)

·本期特稿·

維生素D及其代謝產(chǎn)物水平測定研究的進展Δ

耿春梅*，江 沛，郭玉金#

(濟寧市第一人民醫(yī)院臨床藥學科，山東 濟寧 272011)

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.04.001

維生素D是人體必需的營養(yǎng)素，血清維生素水平影響著人體內(nèi)鈣和磷的正常代謝，與心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)，對人體健康發(fā)揮著重要作用。因此，維生素D水平的測量對診斷、治療和預防維生素相關(guān)疾病有重要意義。25-羥基維生素D[25-(OH)D]不僅是維生素D在體內(nèi)的主要表現(xiàn)形式也是評價體內(nèi)維生素含量的重要指標。色譜分析法和免疫分析法等均可檢測血清25-(OH)D水平，并根據(jù)測定結(jié)果對人體維生素D的營養(yǎng)狀況做出評價并在一定程度上給予補充治療?，F(xiàn)就常用的血清25-(OH)D質(zhì)量濃度檢測方法和維生素D補充進行綜述。

1 維生素D及其代謝產(chǎn)物

維生素D是維持人類身體健康所必需的脂溶性維生素，但人體自身不能合成維生素D，陽光照射和食物攝取是人體維生素D的主要來源。維生素D2和維生素D3是維生素D的主要存在形式，必須在體內(nèi)經(jīng)過2次羥化才能發(fā)揮其生理作用。維生素D2和維生素D3經(jīng)過血液循環(huán)進入肝臟，在肝臟25-羥化酶作用下轉(zhuǎn)化為25-(OH)D2和25-(OH)D3，統(tǒng)稱為25-(OH)D，25-(OH)D再經(jīng)過腎臟25-(OH)D-1α羥化酶的催化轉(zhuǎn)化成有生物活性的1,25-(OH)2D或24,25-(OH)2D[1-2]。1,25-(OH)2D被認為是最具生物活性的代謝物形式，24,25-(OH)2D通常被認為是25-(OH)D直接轉(zhuǎn)化的的代謝物。24,25-(OH)2D和25-(OH)D都可作為體內(nèi)維生素D狀態(tài)的標記物。維生素D、25-(OH)D和1,25-(OH)2D在體內(nèi)的半衰期分別為24 h、3周和4 h[3-4]。其中，25-(OH)D是血液中主要作用形式，其最穩(wěn)定、濃度最高、半衰期最長，因此，人體血清25-(OH)D水平是衡量體內(nèi)維生素D營養(yǎng)狀況的最佳指標[5]。一般分別把血清25-(OH)D質(zhì)量濃度<20、20～30、>30 ng/ml定義為維生素D缺乏、不足和充足[6]。

維生素D是機體內(nèi)源性物質(zhì)，在物質(zhì)代謝中起調(diào)節(jié)作用。維生素D除了具有傳統(tǒng)意義上的骨骼效應外[7]，25-(OH)D水平在心血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、肥胖、神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮著重要作用[8-10]。維生素D缺乏在全球人群中非常普遍，往往是攝入少和陽光暴露少造成的。維生素D缺乏和多種骨質(zhì)疾病的發(fā)病直接相關(guān)，如兒童佝僂病以及成人的骨質(zhì)疏松癥等；同時，維生素D缺乏還會引發(fā)代謝性疾病和特殊惡性腫瘤[11-12]。因此，應建立可靠、靈敏、高效的維生素D水平檢測方法，為臨床上維生素相關(guān)疾病的診斷、預防和治療提供一定的科學參考。

2 維生素D水平檢測方法

目前維生素D水平的檢測獲得越來越多人的關(guān)注，很多醫(yī)院和實驗室把人體血清維生素D質(zhì)量濃度檢測作為一種常規(guī)檢測，用于診斷和治療維生素相關(guān)疾病。色譜測定方法和免疫測定方法是常用的兩種分析方法。免疫分析法不能區(qū)分維生素D本身和類似物，只能測定25-(OH)D總量，無法同時測定25-(OH)D2和25-(OH)D3的質(zhì)量濃度；色譜分析法包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[13-15]，能夠區(qū)分25-(OH)D2和25-(OH)D3并測定其含量。

2.1 HPLC

HPLC具有較高的靈敏度、特異性和準確性，可以同時檢測25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，與 LC-MS/MS測定結(jié)果的一致性良好。與免疫分析法比較，HPLC具有精確度高、分離效能高、分析速度快、重復性好、自動化高等優(yōu)點。但HPLC的不足是設備較貴、檢測通量小、樣品前處理過程復雜、對操作人員要求較高等，目前臨床上較少采用HPLC檢測25-(OH)D水平。另外，HPLC雖能夠同時檢測25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，但其檢測限達不到測定要求，無法測量低質(zhì)量濃度25-(OH)D2。

2.2 LC-MS/MS

LC-MS/MS是應用最多的檢測維生素D及其代謝產(chǎn)物水平的色譜法，樣本經(jīng)處理后采用液相色譜分離，檢測器為質(zhì)譜儀，在多反應離子監(jiān)測掃描模式下，實現(xiàn)分子離子和碎片離子的質(zhì)量選擇，可同時檢測到25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D和1,25-(OH)2D3，具有很高的靈敏度、特異性和準確性，被國際公認為檢測維生素D水平的“金標準”檢測方法。雖然LC-MS/MS在檢測25-(OH)D水平方面具有明顯優(yōu)勢，但樣本需求量較大、樣本前處理繁瑣費時、儀器昂貴、儀器操作復雜、對 操作技術(shù)人員的要求較高，而且需要自己開發(fā)方法等，這在某種程度上限制了其的臨床應用。Tai等[16]曾采用二氯甲烷-正己烷液液萃取提取法、LC-MS/MS法檢測血清25-(OH)D2和25-(OH)D3樣本，考察和評價其方法學。結(jié)果顯示，LC-MS/MS能夠?qū)?5-(OH)D2和25-(OH)D3分離并同其各自的同分異構(gòu)體分離開，在信噪比約為3時，檢測限約為0.15 ng/g。Assar等[17]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定了25-(OH)D2、25-(OH)D3和24,25(OH)2D，血漿樣品先用乙腈沉淀蛋白，然后采用固相萃取進行純化，純化的樣品溶液進行衍生化并在超高效液相色譜儀上進樣分析；流動相A為水(含0.1%甲酸和5 mM甲酸銨)，流動相B為甲醇-水-乙腈(V∶V∶V=97 ∶2 ∶1，含0.1%甲酸和5 mM甲酸銨)，以一定比例進行梯度洗脫，流速為0.35 ml/min，柱溫為45 ℃；最低定量限為0.2 nmol/L。Ding等[18]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定了血漿25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D3、 1,25-(OH)2D2和1,25-(OH)2D3含量，考察并驗證了其方法學，結(jié)果顯示，25-(OH)D2、25-(OH)D3、24,25(OH)2D3、1,25-(OH)2D3和1,25-(OH)2D2的線性范圍分別為2.5～300.0、2.5～300.0、0.1～300.0、0.1～50.0和0.2～50.0 ng/ml，日內(nèi)和日間精密度CV<10%，回收率為55%～85%。因此，LC-MS/MS作為“金標準”方法檢測維生素D及其代謝產(chǎn)物，具有較好的準確度和精密度，可以用來與臨床其他檢測維生素D的方法作相關(guān)性比較。

2.3 免疫分析方法

免疫分析法包括放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、化學發(fā)光免疫測定法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)、電化學發(fā)光免疫測定法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、全自動生化分析法等，由于所有維生素D羥化物都能發(fā)生抗體抗原結(jié)合反應，因此，只能測定25-(OH)D總量，無法同時測定25-(OH)D2和25-(OH)D3的質(zhì)量濃度。

RIA應用廣泛，是最經(jīng)典的測定機體內(nèi)25-(OH)D水平的方法，操作簡單、樣品前處理簡單。雖然RIA不可以同時檢測出25-(OH)D2和25-(OH)D3，但是有研究結(jié)果證明RIA對血清25-(OH)D水平測定的結(jié)果與“金標準”LC-MS/MS測定結(jié)果的相關(guān)性好(R>0.90)[19]，適用于臨床常規(guī)檢測。

ELISA是早期維生素D水平測定的常用方法，其在自動化操作、節(jié)省人力、無污染等方面具有一定優(yōu)勢，適合常規(guī)臨床實驗室開展。但ELISA對基質(zhì)敏感，容易發(fā)生交叉反應，導致方法特異性不足[20]。研究結(jié)果表明，ELISA對血清25-(OH)D水平測定的結(jié)果明顯高于“金標準”LC-MS/MS[21]。ELISA作為大規(guī)模篩查維生素D缺乏及過量的方法，仍有一定優(yōu)勢，目前仍被廣泛用于臨床的體外診斷。

CLIA自動化程度高、操作簡單、快速，但儀器昂貴、只能用于檢測25-(OH)D總量。Frenzel等[22]比較了LIAISON CLIA測定25-(OH)D水平的結(jié)果分別與Dia RIA、LC-MS/MS的相關(guān)性，結(jié)果顯示，CLIA與RIA測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R=0.94，與LC-MS/MS測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R=0.95。CLIA結(jié)果測定準確，適用于大樣本維生素D含量水平監(jiān)測。

ECLIA靈敏度高，干擾較少，可自動化批量操作。Van den Ouweland等[23]和Leino等[24]對比分析了羅氏E170型電化學發(fā)光免疫分析儀與LC-MS/MS檢測25-(OH)D水平結(jié)果的一致性，發(fā)現(xiàn)ECLIA與LC-MS/MS檢測結(jié)果的一致性較好。可見，ECLIA法測定維生素D的準確度、精密度、可重復性等均符合臨床監(jiān)測要求。

全自動生化分析法使用全自動生化儀，操作簡便、測量迅速、準確度高、消耗試劑量小，在各級醫(yī)院得到了廣泛應用。全自動生化分析儀之間分析性能差異大，特異性差，日內(nèi)和日間精密度不穩(wěn)定，待測樣品間易交叉污染[25]。宋愛華[26]評估了全自動生化法和CLIA方法測定25-(OH)D含量結(jié)果的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R=0.994 1[27]，表明此方法可滿足維生素D水平的測量，適用于各級醫(yī)院臨床常規(guī)監(jiān)測維生素D水平。

3 維生素D補充

一項研究結(jié)果表明，高緯度地區(qū)人口更易伴隨維生素D缺乏，因此，維生素D補充迫在眉睫，其可降低維生素相關(guān)疾病發(fā)生的風險，提高人們生活質(zhì)量或延長人的壽命[28]。食物攝取或充足的陽光照射是北方地區(qū)傳統(tǒng)上補充維生素D的最好方法。然而，高緯度地區(qū)人口維生素D合成障礙和食物攝取偏愛使維生素D補充具有一定難度，因此，鼓勵其從多個來源進行維生素D的補充以保證人體最佳生理功能[29]。

維生素D補充劑量和如何補充，是個值得探討的全民問題。美國醫(yī)學研究所(institution of medicine，IOM)最近的建議(2011年起)只考慮到維生素D對骨骼健康和骨折復位的作用。IOM推薦1～70歲的人每日攝入維生素D 600 IU，年齡更大者攝入800 IU。成年人攝入維生素D的上限是4 000 IU/d。機體內(nèi)維生素含量過高易造成血管和組織鈣化。很多相關(guān)研究人員和健康組織不同意IOM推薦的維生素D日攝入量，認為每日應該攝入維生素D 800～2 000 IU，認為對于維生素D水平低的人而言，每日應該攝入維生素D 800～2 000 IU。血液中維生素D的質(zhì)量濃度至少在30 ng/ml，也有人認為40或50 ng/ml更好。由于對維生素D測定標準及結(jié)果認同無統(tǒng)一標準，緬因州醫(yī)療中心研究所的Clifford Rosen和加利福尼亞大學的Janice M. Schwartz教授都推薦成年人應該每日攝入維生素D 800～1 000 IU。補充維生素D3是補充維生素的首選形式，在保持25-(OH)D水平方面，維生素D3的有效性約比維生素D2高50%～80%[30]。但是，還要根據(jù)不同個體的情況，個體化、合理補充維生素D。

綜上所述，維生素D是人體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，維生素D缺乏與機體代謝障礙及很多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。人體內(nèi)25-(OH)D的含量測定需求日益增大。目前，臨床常用的方法有色譜法和免疫分析法，不同方法檢測25-(OH)D水平的結(jié)果可能出現(xiàn)不同程度的差異，因此，在選擇方法時，應根據(jù)靈敏度、特異性、測定費用、測定時間及實驗人員能力和實驗室條件等實際情況綜合考慮。更重要的是，可根據(jù)不同個體測得的血清25-(OH)D含量，做到科學、合理地補充維生素D，達到治病防病的目的。針對不同個體如何進行個體化維生素D補充是醫(yī)藥工作者面臨的任務和挑戰(zhàn)，個體化、合理補充才能讓維生素D更好地為人們的健康服務。

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國家自然科學基金(No.81602846)

R977.2

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2017-02-20)

*碩士研究生。研究方向：臨床藥理學。E-mail：gengchunmei8@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：臨床藥理學。E-mail：gyj99@126.com