Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中的免疫調節(jié)作用

趙小瑜 朱堅勝

Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中的免疫調節(jié)作用

趙小瑜 朱堅勝

慢性HBV感染者體內(nèi)免疫細胞存在功能障礙，免疫功能無法發(fā)揮正常作用；其CD4+、CD8+T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞表面存在Tim-3、PD-1的過度表達。大量文獻表明該現(xiàn)象與HBV持續(xù)感染、疾病的發(fā)生發(fā)展以及預后密切相關，推測Tim-3、PD-1或許可作為新的免疫靶點治療慢性乙型肝炎。

HBV免疫調節(jié)Tim-3PD-1

慢性HBV感染在全世界范圍內(nèi)流行，據(jù)WHO報道全球約20億人曾感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者[1]；每年死于慢性HBV感染引起的并發(fā)癥如肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌的人數(shù)高達65萬[2]。慢性乙型肝炎（CHB）的病原體是HBV，它通過誘發(fā)被感染機體發(fā)生一系列免疫應答來影響病情發(fā)展，其中樹突狀細胞、NK細胞、單核/巨噬細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞等免疫細胞所介導的免疫反應在慢性HBV感染中起著重要作用。有研究表明在CHB患者體內(nèi)，以上免疫細胞存在不同程度的功能障礙，但引起該現(xiàn)象的機制尚未明確[3-6]。近年來，一些免疫分子在上述免疫細胞上的表達成為研究熱點，其中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞上的T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）、程序性死亡受體-1（PD-1）的過度表達與慢性HBV感染密切相關，本文就以上2種免疫分子在慢性HBV感染過程中的免疫調節(jié)作用作一綜述。

1 Tim-3

1.1 概述Tim-3是近幾年慢性病毒感染以及腫瘤免疫研究的熱點。Tim-3屬于Tim家族，最早是McIntire等[7]在研究與哮喘相關的基因時發(fā)現(xiàn)，它是一段編碼免疫球蛋白可變域和黏蛋白域的T細胞膜蛋白的基因?，F(xiàn)已研究表明Tim基因共有8個，可編碼4種蛋白，在鼠類為Tim-1、Tim-2、Tim-3和Tim-4，在人類為Tim-1、Tim-3和Tim-4[7]。所有Tim家族成員均為Ⅰ型細胞表面跨膜糖蛋白，包括信號序列、N端免疫球蛋白樣結構域、黏蛋白結構域、跨膜區(qū)和包含酪氨酸磷酸化基的胞內(nèi)區(qū)[8]。Tim-3與其配體半乳糖凝集素-9（Gal-9）所組成的信號通路在慢性病毒感染及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。前期關于Tim-3在慢性病毒感染中免疫抑制作用的研究表明，如在HCV感染者外周血T淋巴細胞上的Tim-3表達高于健康者，當阻斷Tim-3信號通路后，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的增殖和分泌功能也得到部分恢復[9]。此外，當HIV感染時，患者外周血NK細胞和T淋巴細胞上的Tim-3表達增加，經(jīng)高效抗逆轉錄病毒治療后，部分免疫應答患者Tim-3表達較治療前有所下降[10]。而在腫瘤免疫中，Tim-3表達亦明顯增強，甚至與疾病預后相關[11-13]。以上研究提示Tim-3的表達與慢性病毒感染及腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關。

1.2 Tim-3與慢性HBV感染相關文獻表明Tim-3在慢性HBV感染中發(fā)揮著免疫負調節(jié)作用。Rong等[14]研究發(fā)現(xiàn)在CHB患者外周血單個核細胞和NKT細胞表面的Tim-3表達較健康者明顯升高，且在乙肝慢加急性肝衰竭患者中表現(xiàn)更為明顯。Ying等[15]研究結果與其相似，此外課題組利用轉染HBV的NK92細胞系以及HBV轉基因小鼠模型，證實肝臟中NK細胞、CD8+T淋巴細胞上的Tim-3表達也明顯上調；在此基礎上進一步利用Tim-3抗體阻斷Tim-3/Gal-9信號通路，發(fā)現(xiàn)NK細胞的細胞毒活性增強，且其分泌IFN-γ的量也相應增加。Wei等[16]研究結果顯示，與健康者相比，CHB患者和急性乙型肝炎（AHB）患者外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞上的Tim-3表達均明顯增強，且與疾病嚴重程度呈正相關；進一步隨訪發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗病毒治療后，CHB患者的病情進入緩解期，AHB患者的病情進入恢復期時，其外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞上的Tim-3表達均明顯下調。以上研究結果均提示Tim-3的過表達與CHB的發(fā)生、發(fā)展有關，且可能與疾病預后有關。此外，體外實驗證實阻斷Tim-3信號通路后，CHB患者外周血來源的CD8+T淋巴細胞在應對HBV抗原刺激時的增殖能力、分泌抗病毒細胞因子的能力均明顯增強[17]；Nebbia等[18]研究結果亦證實了該結論。CHB是一種家族聚集性傳染病，Liao等[19]研究發(fā)現(xiàn)Tim-3的基因多態(tài)性與HBV感染后的病情發(fā)展相關，他們猜測某個特定的單核苷酸多態(tài)性更有潛能進展為肝細胞癌或實現(xiàn)HBsAg血清學轉化。

2 PD-1

2.1 概述PD-1是由2號染色體上Pdcd1基因編碼、由288個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，作為受體表達于活化的T淋巴細胞上[20]。它最初是利用削減雜交方法在凋亡的小鼠T淋巴細胞雜交瘤中得到，是首個被發(fā)現(xiàn)用于識別淋巴細胞功能受損的表面標志物，屬于B7/CD28超家族成員。PD-1目前已知有2個配體，即PD-L1和PD-L2。PD-L1也稱B7-H1或CD274，是人類9號染色體Cd274基因編碼、由290個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，表達于抗原提呈細胞和腫瘤細胞上，與PD-1結合主要起免疫抑制作用[21]。PD-L2也稱B7-DC或CD273，能被誘導表達于樹突狀細胞、巨噬細胞上[22]，具有抑制T淋巴細胞活化的功能[23]。PD-1在慢性病毒感染中的免疫調節(jié)作用首次在小鼠淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染模型中發(fā)現(xiàn)，研究者發(fā)現(xiàn)在慢性感染小鼠體內(nèi)衰竭的CD8+T淋巴細胞上存在著高表達的PD-1，而在清除病毒后的小鼠體內(nèi)有記憶功能的CD8+T淋巴細胞上并不存在這種現(xiàn)象[24]；此外，在小鼠體內(nèi)試驗中阻斷PD-1/PD-L1信號通路，會使病毒特異性CD8+T淋巴細胞數(shù)量增加、細胞功能強化，甚至會對病毒復制產(chǎn)生干擾[24]。在其他慢性病毒感染如HIV感染，Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)病情進展組患者外周血CD8+T淋巴細胞上PD-1的表達高于病情無進展組，且細胞功能更弱；當阻斷PD-1信號通路時，CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ的能力得到部分恢復，且與HIV的易感性相關[26]。對于慢性HCV感染，有研究證實PD-1在T淋巴細胞上的表達量與其抗病毒療效相關[27]。PD-1不僅在慢性病毒感染中發(fā)揮著重要作用，在腫瘤免疫中也具有重要調控作用。有研究報道可在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤組織中檢測到PD-L1高表達，亦有體內(nèi)外實驗證實轉染PD-L1的細胞表現(xiàn)出較弱的抗腫瘤侵襲能力[28]。近年來有一些研究機構開展的臨床試驗結果預示了抗PD-1藥物在未來腫瘤免疫治療中的潛在價值[29-30]。

2.2 PD-1與慢性HBV感染目前已有相關文獻表明在HIV[25，31-32]、HCV[33-34]等慢性病毒感染中，PD-1信號通路在抑制病毒特異性CD8+T淋巴細胞的功能時具有重要的免疫調節(jié)作用。那么，PD-1在慢性HBV感染中的免疫調節(jié)作用如何？Peng等[35]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者的HBV特異性CD8+T淋巴細胞上的PD-1表達明顯高于AHB組和健康組，且與血清中的HBV-DNA病毒載量呈正相關。Germanidis等[36]將53例HBeAg陰性的CHB患者（包括30例處于病情活動期的患者和23例經(jīng)長期抗病毒治療后病情完全緩解者）納入研究，結果表明在病情緩解狀態(tài)下，肝組織上表達的叉頭樣轉錄因子P3、PD-1、PD-L1水平明顯低于病情活動期，這提示PD-1可能與CHB預后有關。另有一項研究發(fā)現(xiàn)在慢性HBV感染的不同階段（免疫耐受、免疫清除、病毒攜帶），外周血CD4+T淋巴細胞上的PD-1表達均高于健康者。此外有研究發(fā)現(xiàn)PD-1表達增加是由HBcAg通過JNK、ERK和PI3K/AKT信號通路誘導而發(fā)生[37]。Tzeng等[38]構建HBV感染模型小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)在HBV感染小鼠肝臟浸潤性淋巴細胞上的PD-1表達增加，在小鼠體內(nèi)阻斷PD-1發(fā)現(xiàn)其HBV感染率下降。在體外實驗中，Raziorrouh等[39]對CHB患者外周血來源的單個核細胞進行體外培養(yǎng)并阻斷PD-1通路，發(fā)現(xiàn)上述來源的單個核細胞中CD4+T淋巴細胞的增殖能力再度活化，且其分泌Th1型細胞因子如IFN-γ、TNF-α也相應增加。雖然CHB患者外周血或組織細胞上的PD-1表達上調程度存在個體差異且與病情相關，但Ulger等[40]用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析表明與PD-1的基因多態(tài)性無關，這與Li等[41]研究結果不同，其具體機制尚需進一步探索。

3 Tim-3、PD-1與慢性HBV感染

由上可知，在包括HBV感染等慢性病毒感染過程中，Tim-3、PD-1各自起著負性調控免疫應答的作用。那么，同樣作為免疫分子，這兩者之間是否存在某種聯(lián)系呢？Keir等[20]、Sharpe等[22]、Crawford等[42]曾提出阻斷PD-1/PD-L1信號通路并不能完全恢復“衰竭”T淋巴細胞的功能，可見還存在其他調控分子對T淋巴細胞的功能起著負性調控作用。為了證實在慢性病毒感染過程中Tim-3與PD-1是否共表達在CD8+T淋巴細胞上，Jin等[43]研究了在急性和慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染時病毒特異性CD8+T淋巴細胞上的Tim-3、PD-1表達情況，發(fā)現(xiàn)慢性感染時Tim-3、PD-1表達均明顯高于急性感染時；共表達Tim-3、PD-1的病毒特異性CD8+T淋巴細胞表現(xiàn)出更為嚴重的“功能衰竭”；在病毒感染小鼠體內(nèi)同時阻斷Tim-3和PD-1信號通路能明顯改善CD8+T淋巴細胞的免疫應答并有效控制病毒，這種效應比單獨阻斷Tim-3或PD-1任一信號通路更為明顯。Li等[41]利用PCR方法檢測了845例慢性HBV感染者、141例感染過HBV且自行恢復者和318例健康者的Tim-3、PD-1基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)這3組人群在PD1+8669 G/A、Tim3-1516 G/T兩個位點的多態(tài)性存在差異，且與HBV導致的肝硬化、肝癌等密切相關，這提示在慢性HBV感染時，PD-1、Tim-3表達均增高。HBV導致的CHB、慢加急性肝衰竭患者中，其外周血CD8+T淋巴細胞上的Tim-3、PD-1表達均明顯高于健康者，尤其是慢加急性肝衰竭患者的表達量更高[43]。Nebbia等[18]研究證實在慢性HBV感染過程中，在阻斷PD-1通路的基礎上再阻斷Tim-3/Gal-9通路，對于HBV特異性T淋巴細胞免疫應答的增強可起到補充作用，提示了這2條通路對免疫抑制的相互協(xié)同作用。

4 總結

Tim-3、PD-1不僅在慢性病毒感染中具有免疫抑制作用，在腫瘤、自身免疫性疾病等其他慢性疾病中也具有重要的免疫調節(jié)作用。目前關于Tim-3、PD-1在慢性HBV感染中免疫調節(jié)作用的研究越來越多，這2種免疫分子的過表達會影響免疫細胞的免疫活性，削弱其清除病毒的能力。建議學者積極探索慢性HBV感染過程中Tim-3、PD-1信號通路的靶點干預，研發(fā)新藥物，為CHB臨床治療提供幫助。

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2016-07-25）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012KYB237）

317000溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院感染科

朱堅勝，E-mail：zhujs@enzemed.com