人諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

袁越 袁鑫 新燕 龐立麗

010000 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)專業(yè)(袁越、新燕)；400044 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物工程專業(yè)(袁鑫)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點實驗室(龐立麗)

人諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

袁越 袁鑫 新燕 龐立麗

010000 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)專業(yè)(袁越、新燕)；400044 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物工程專業(yè)(袁鑫)；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點實驗室(龐立麗)

人諾如病毒(Norovirus，NoV)是單股正鏈的RNA病毒，它是引起全球急性胃腸炎流行和暴發(fā)的主要病原體之一，目前已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。由于缺乏合適和成熟的動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，人們對人諾如病毒的流行病學(xué)及其基因變異特征的研究較多，但對于病毒的生物學(xué)特性、病毒編碼蛋白的功能特征及病毒感染和致病機(jī)制知之甚少。本文簡要總結(jié)了諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展，并期望隨著最近人諾如病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的突破，為進(jìn)一步開展人諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究提供借鑒。

人諾如病毒(Norovirus，NoV)，其最早的原型病毒被稱為諾瓦克病毒(Norwalk Viruses)，它是在美國諾瓦克鎮(zhèn)急性胃腸炎暴發(fā)疫情中患者的糞便標(biāo)本中被首次發(fā)現(xiàn)的。自從1972年被發(fā)現(xiàn)以來， NoV已經(jīng)被確認(rèn)為是引起全球急性胃腸炎的主要病因[1]。由于缺乏合適的動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，人們對人諾如病毒的復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)制的認(rèn)識進(jìn)展緩慢。近些年，通過感染性克隆和重組表達(dá)系統(tǒng)的研究，對諾如病毒基因編碼的蛋白質(zhì)功能的認(rèn)識有了一些進(jìn)展。諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因組的復(fù)制、翻譯以及拮抗宿主免疫反應(yīng)的過程中起到重要的作用，但是關(guān)于非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制和致病過程中的具體作用尚不清楚，有待于我們更深入地研究病毒蛋白的功能以及與細(xì)胞蛋白質(zhì)之間的相互作用[2]。開展諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的研究有助于進(jìn)一步了解諾如病毒的致病機(jī)制。這篇綜述簡要闡明了NoV非結(jié)構(gòu)蛋白的功能的最新研究進(jìn)展，以便更全面地了解NoV的生物學(xué)特征和致病機(jī)制。

1 NoV的基因結(jié)構(gòu)

NoV屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，是無包膜的二十面體對稱結(jié)構(gòu)的病毒，直徑為28～30 nm，表面粗糙，呈球形。NoV的基因組是單股正鏈RNA，全長約7.3～7.7 kb, GC含量為48%，NoV基因組3′端是多聚腺苷酸，5′端共價連接到病毒編碼蛋白VPg。NoV基因組包括三個開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)，分別為ORF1、ORF2和ORF3。ORF1編碼相對分子質(zhì)量約200×103的蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后產(chǎn)生6個非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為P48、NTP酶、P22、3C樣蛋白酶、VPg和依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)，它們均在病毒的復(fù)制中起著十分重要的作用。ORF2編碼一個相對分子質(zhì)量為56×103的衣殼蛋白VP1; ORF3編碼相對分子質(zhì)量約22×103的次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2。根據(jù)諾如病毒的RdRp區(qū)和衣殼蛋白區(qū)的核苷酸序列，現(xiàn)將其分為七個基因組，GI、GII、 GIII、GIV、 GV、GVI和GVII[3]。其中GI細(xì)分為9種基因型，GII由22種基因型組成[3-4]?；蚪MG I、GII和GⅣ可感染人，基因組GIII、GV和GVI以及GVII分別感染牛、鼠和狗。GI和GII是引起人類急性胃腸炎的兩個最主要諾如病毒基因組。

2 非結(jié)構(gòu)蛋白

2.1P48P48又稱為N端蛋白，即NS1-2,相對分子質(zhì)量大小在37～48×103之間，由398個氨基酸組成[5]。NS1-2在N末端含有高度無序的脯氨酸，在C末端有跨膜結(jié)構(gòu)域，是半胱天冬酶的切割位點[6]。GI組和GII組NoV P48的長度和序列上各不相同，在此蛋白的C末端，氨基酸具有保守性。GII組camberwell毒株P(guān)48蛋白裂解產(chǎn)生兩個相對分子質(zhì)量大小為15×103和22×103的蛋白質(zhì)。在用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)對GI型毒株和GII型MD-145毒株的研究中，并沒有觀察到P48的進(jìn)一步水解，但并不排除它會在一些未檢測到的低水平上進(jìn)行水解[7-8]。

參與細(xì)胞增殖調(diào)控的細(xì)胞蛋白H-rev107和TIG3具有Hbox/NC基序，Hughes和Stanway指出NoV P48中也有Hbox/NC基序。這些基序如果發(fā)揮作用，那么P48的功能就會得到進(jìn)一步的研究。通過序列分析，預(yù)測到在P48的C端360-379氨基酸附近存在一個疏水區(qū)。 C-末端的穿膜區(qū)(Transmembran, TM)對P48定位不是必須的，但是對P48在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運有重要作用。P48與囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白(Vesicle-associated membrane protein-Associated ProteinA,VAP-A)相互作用，而VAP-A在SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)介導(dǎo)調(diào)節(jié)囊泡融合中扮演著重要作用。由于RNA病毒復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的膜上，P48可能是通過VAP-A錨定膜相關(guān)復(fù)制復(fù)合物。通過共聚焦顯微鏡分析顯示在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的諾如病毒的N端蛋白與高爾基體共定位，從而導(dǎo)致高爾基復(fù)合體拆卸變成離散的聚集體。諾如病毒N末端蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)與高爾基體的拆卸有關(guān)。Fernandez-Vega等[9]報導(dǎo)過度表達(dá)P48蛋白會促進(jìn)高爾基復(fù)合體的拆卸，并阻礙細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)和運輸，以促進(jìn)細(xì)胞膜向其復(fù)制復(fù)合物的募集。P48 N端蛋白的功能到目前為止是未知的，可能在膜重排和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用。

2.2P41核苷酸水解酶P41即NS3，與小RNA病毒基因組2C結(jié)構(gòu)類似。貓杯狀病毒(Feline Calicivirus, FCV)P41序列中有一個NTP結(jié)合基序GPPGIGKT[10]。P41蛋白具有A、B和C三個基序。純化的P41可以體外結(jié)合ATP，A基序中的第168個氨基酸的突變會導(dǎo)致其ATP結(jié)合活性消失[11]。P41可以水解ATP，但無法解開合成的RNA：DNA異源雙鏈。除去可以水解ATP，諾如病毒P41可以水解所有NTPs。這些數(shù)據(jù)表明，P41具有核苷水解酶活性，但不具有解旋酶活性。另外，1 mmol/L 鹽酸胍可以抑制腸道病毒的2C ATP酶活性，但是不能抑制NoV P41的NTP酶活性。這種濃度的鹽酸胍能在細(xì)胞培養(yǎng)中有效地抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制，近期成功用人類腸道組織培養(yǎng)人諾如病毒，可以成為研究NoV具有鹽酸胍抗性分子機(jī)制的平臺，推進(jìn)對NoV復(fù)制機(jī)制的研究。

NS3蛋白與細(xì)胞骨架標(biāo)志物β微管蛋白共定位，并且誘導(dǎo)形成定位于細(xì)胞膜的離散水泡結(jié)構(gòu)。通過熒光顯微鏡可以觀察到這些結(jié)構(gòu)是高度動態(tài)的并依賴微管轉(zhuǎn)運。NoV NS3更多地定位于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鼠諾如病毒(murine norovirus, MNV)NS3更多地定位于富含鞘脂類和膽固醇類的區(qū)域。MNV和NoV NS3蛋白質(zhì)以不同的方式與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)締合，這可能在病毒復(fù)制和復(fù)制復(fù)合物建立期間影響其在宿主細(xì)胞內(nèi)的潛在功能。人類NoV NS3和MNV NS3這兩種蛋白質(zhì)在氨基酸水平上存在高度的保守性，這意味著在NoV和MNV的復(fù)制周期期間具有潛在的保守功能[12]。

2.3P22P22在NoV基因組的位置類似于在小核糖核酸病毒基因組中3 A蛋白的位置[13]。脊髓灰質(zhì)炎病毒的3 A蛋白對復(fù)制復(fù)合物的膜定位非常重要，靶向突變的3 A產(chǎn)生的病毒，其RNA合成能力有缺陷，抑制細(xì)胞分泌途徑的能力降低。與3 A的復(fù)制相關(guān)屬性一致，從FCV感染的細(xì)胞中分離出的具有聚合酶功能的膜復(fù)合物中存在p30，而FCV p30與NoV P22相似[14]。

從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)到高爾基體蛋白質(zhì)的運輸是由在COPII蛋白復(fù)合物中囊泡介導(dǎo)的，而相反的途徑從高爾基體到ER蛋白質(zhì)的運輸則是由COPI包被的囊泡介導(dǎo)的，人諾如病毒P22的表達(dá)導(dǎo)致分泌途徑中各種成分的重排和改變。由于氨基酸112-127之間的兩親α-螺旋，殘基103-148負(fù)責(zé)P22的膜結(jié)合。諾如病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白P22編碼一種獨特的而且保守的基序，其基序模仿傳統(tǒng)的二酸性ER基序的信號輸出。由于NoV、MNV和FCV均誘導(dǎo)高爾基體解離，比較杯狀病毒中的同源物P22如下特征：序列相似性、保守基序、 細(xì)胞分布和位置、誘導(dǎo)高爾基體解離的能力和抑制細(xì)胞蛋白分泌。在氨基酸50-148之內(nèi)具有兩個明顯的保守性序列，其一是膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Membrane association domain，MAD)基序,具有良好的保守性序列并在所有的基因型中有著相似的作用。其二是YXΦESDG基序,模擬ERES(ER exit sites)抑制COPII小泡運輸?shù)鞍?，其中的Y和E殘基在導(dǎo)致高爾基體解離，拮抗依賴高爾基體的細(xì)胞蛋白分泌，抑制細(xì)胞分泌通路中扮演著重要的角色。兩親性α-螺旋是存在于人類NoV和MNV P22同源物中相應(yīng)的氨基酸112-127之間MAD。通過對所有NoV P22 L比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P22都會抑制細(xì)胞蛋白分泌，并在細(xì)胞定位上具有不同程度的差異。

2.4VPgVPg即NS5，在小RNA病毒中，VPg的長度是22個氨基酸。在諾如病毒中，VPg長度是133個氨基酸，相對分子質(zhì)量大約為15×103共價連接到mRNA的基因組和亞基因組的5′末端[15]。NS5的表達(dá)誘導(dǎo)G0 / G1期停滯。 VPg在體外表達(dá)體系和培養(yǎng)的感染細(xì)胞中能夠與翻譯起始因子結(jié)合，因而它被認(rèn)為能夠啟動轉(zhuǎn)錄推測這種病毒蛋白質(zhì)在病毒基因組的復(fù)制中起著重要的作用，類似于小RNA病毒中VPg的作用，并能促進(jìn)RNA合成。VPg對于諾如病毒基因組和亞基因組RNA的翻譯起始是必需的，并且似乎也起到核糖體的募集作用。在RNA合成中，諾如病毒VPg含有酪氨酸，類似于人諾如病毒的Tyr27，其羥基側(cè)鏈涉及RNA合成。VPg蛋白質(zhì)與eIFs相互作用并起到替代一種帽狀蛋白質(zhì)的作用[16]。

MNV通過VPg26位酪氨酸共價連接鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)。VPg與支架蛋白 eIF4G直接作用[16-17]。MNV VPg蛋白C端20aa介導(dǎo)了與eIF4G 4GM片段中的HEAT-1區(qū)特異直接的結(jié)合。據(jù)報道，缺乏VPg的杯狀病毒基因組RNA不具有傳染性，但它有保護(hù)人NoV基因組免受宿主免疫系統(tǒng)識別的作用[18]。FCV 的VPg和VP1相互作用，可能有助于選擇性包裝VPg偶聯(lián)的病毒RNA。實驗表明VPg在病毒RNA翻譯中起作用，除去FCV 基因組RNA中的VPg會降低病毒蛋白體外合成的水平。推測VPg可以作用于病毒RNA對核糖體的募集包裝新合成的病毒基因組[19]。

2.53C樣蛋白酶NoV編碼一個單一的蛋白酶，由于它與小核糖核酸3C類似，因此又被稱為3C樣蛋白酶(3C-like protease，3CLpro)，屬于糜蛋白酶樣蛋白酶家族的一員，它的相對分子質(zhì)量大小約為19×103。3CLpro與細(xì)胞內(nèi)的胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(chymotrypsin-like serine proteases)的結(jié)構(gòu)相似，與小RNA病毒的3CLpro具有相同的氨基酸序列基序，主要在QG、EG和EA這三個裂解位點把諾如病毒的開放閱讀框1(Open reading frame 1，ORF1)多聚蛋白加工成非結(jié)構(gòu)蛋白[20]。

3CLpro的活性位點由氨基酸His30、Glu54, 和 Cys139這三個催化三聯(lián)體組成[21- 22]。此外，除了在切割病毒蛋白質(zhì)中發(fā)揮作用，也通過裂解細(xì)胞多聚腺苷酸A結(jié)合蛋白來抑制細(xì)胞翻譯[23]。在GDSG基序中的Ser195殘基是蛋白質(zhì)水解過程中必不可少的一個親和基的活性部位。Cys139可以取代Ser殘基，對于活性無明顯影響，證實3CLpro是絲氨酸蛋白酶家族的一個成員。小RNA病毒的3CLpro相應(yīng)區(qū)域如β-ribbon，可靈活參與底物結(jié)合[24- 25]。

2.6依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp) NoV RdRp位于ORF1 C端，分子量大小約為57 kDa。隨著RHDV和FCV RdRp的活性報導(dǎo)，確認(rèn)了重組桿狀病毒表達(dá)NVRdRp的體外酶活性。Ng等人揭示了GII型NV Ast6139/01/Sp株 RdRp的晶體結(jié)構(gòu)，并顯示與兔出血癥病毒的RdRp結(jié)構(gòu)普遍相似[26]。NoV RdRp具有其它正鏈RNA病毒RdRp的結(jié)構(gòu)特性，具有聚合酶共有的結(jié)構(gòu)域如手指(Fingers)，手掌(Palm)和拇指(Thumb)。NoV RdRp C末端定位于起催化作用的天冬氨酸殘基附近的活性位點裂縫中。揭示這一小區(qū)域的位置可能類似于QB噬菌體RdRp的“plough”環(huán)，在啟動RNA引物合成中起穩(wěn)定引物的作用。

NoV RdRp和許多病毒RdRps的活性位點發(fā)現(xiàn)都具有保守的氨基酸基序，甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(glycine-aspartic acid-aspartic acid，GDD)。與其他正鏈RNA病毒一樣，NoV基因組RNA可作為負(fù)鏈RNA合成的模板。負(fù)鏈RNA反過來又作為合成子代基因組正鏈RNA分子的模板。因此RdRp對于正負(fù)鏈RNA分子的合成起到十分重要的作用。諾如病毒的RdRp在沒有引物的情況下，也能夠在諾如病毒基因組3′端合成cRNA。3CLpro-RdRp的前體是一個具有兩種功能的蛋白,即蛋白酶和聚合酶活性,體外實驗報導(dǎo)，單獨聚合酶跟前體有類似的活性[27]。諾如病毒的RdRp是在諾如病毒的復(fù)制中起著關(guān)鍵作用的一種酶。通過抑制HCV RdRp并有助于治愈HCV感染，所以病毒RdRps是研發(fā)抗病毒藥物的關(guān)鍵。因此，諾如病毒RdRp的結(jié)構(gòu)和功能研究不僅僅有助于了解諾如病毒復(fù)制，而且也有助于抗病毒藥物的選擇和發(fā)展。

3 結(jié)論和展望

通過以上的總結(jié)，我們不難發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于人NoV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究更多是源于其他杯狀病毒或者小RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的研究或體外非感染性的人諾如病毒單一基因表達(dá)的研究。因此，真實、完整的人諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白研究有待更多更好的模型及深入研究。近期人諾如病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的成功為研究人諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白提供了平臺，將帶動對諾如病毒非結(jié)構(gòu)蛋白未知功能的探索，以更深入地了解人諾如病毒的致病機(jī)制。

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2017-06-20)

(本文編輯：唐瀏英)

Structureandfunctionofhumannorovirusnonstructuralproteins

YuanYue,YuanXin,XinYan,PangLili

DepartmentofImmunology,BasicSchoolofMedicalScience,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China(YuanY,XinY);DepartmentofBioengineering,SchoolofBiologicalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing,China(YuanX);KeyLabortoryofMedicalVirology,MinistryofHealth，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(PangLL)YuanYueandYuanXinarethefirstauthorswhocontributedequallytothisarticle

XinYan,Email:xinyan_2505@126.com;PangLili,Email:cactusea@163.com

Norovirus (NoV), a single stranded RNA virus, is the major causative agent of the global acute gastroenteritis in humans, and it has drawn more and more attention. Because of the lack of appropriate animal models and in vitro cell culture models, people have studied and understood more about the epidemiology and genetic variation of human viruses. The functional characteristics of the viral encoded protein and the pathogenesis of virus infection are poorly understood. In this paper, we summarize the progress in studies on characteristics of non-structural protein of norovirus, and hope that with the recent breakthrough in human cell culture model of human norovirus, it can be used as a tool for further research on the function of human norovirus non-structural protein.

Human norovirus; Calicivirus; Nonstructural protein; Viral replication

袁越與袁鑫對本文有同等貢獻(xiàn)

新燕，Email：xinyan_2505@126.com；龐立麗，Email：cactusea@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.022

諾如病毒,人；杯狀病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白；病毒復(fù)制

國家自然科學(xué)基金(81601813)

FundprogramsNational Natural Science Foundation of China(81601813)