人副流感病毒3型包膜糖蛋白相互作用機制的研究進展

姜晶晶 王志玉

250012 濟南，山東大學公共衛(wèi)生學院病毒學研究室

人副流感病毒3型包膜糖蛋白相互作用機制的研究進展

姜晶晶 王志玉

250012 濟南，山東大學公共衛(wèi)生學院病毒學研究室

人副流感病毒(Human parainfluenza viruses，hPIVs)屬于副粘病毒科的單股負鏈RNA病毒，也是引起呼吸道感染的主要病原體，其中hPIV3是引起六個月以下嬰幼兒發(fā)生細支氣管炎和肺炎的第二大病原體，僅次于呼吸道合胞病毒。本文主要介紹人副流感病毒3型的兩種與毒力相關的表面糖蛋白、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白和融合蛋白(F)，根據(jù)國內外最新的研究進展，介紹其蛋白結構和生理學功能，尤其是在膜融合過程中HN與F的相互作用機制。

人副流感病毒(Human parainfluenza viruses，hPIVs)是副粘病毒科的一類有包膜的單股負鏈RNA病毒，可以感染人類及多種哺乳動物。根據(jù)遺傳學和抗原性的不同，可將其主要分為4個血清型(hPIV-1、2、3、4)，其中hPIV4又分為AB兩種血清亞型(4 A、4B)。雖然hPIVs各型病毒的主要結構相似，但所引發(fā)疾病的臨床特點及流行病學特征各有不同[1]。與hPIVs的其他亞型相比，人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3，hPIV3)的感染率最高的，感染持續(xù)時間更長，其所致疾病的住院率也明顯增高[2]。流行病學研究顯示：hPIV3常年均可檢出，但主要流行于夏、春兩季，是引起六個月以下嬰幼兒發(fā)生細支氣管炎和肺炎的第二大病原體，僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)[3]。迄今沒有有效的疫苗和治療藥物，hPIV3疫苗被WHO列為未來重點研發(fā)的疫苗[4]。

hPIV3電鏡下呈現(xiàn)出多形性，以球形為主，其病毒顆粒直徑一般為150～180 nm，核衣殼呈螺旋對稱性。hPIV3基因組約有15 000個核苷酸，編碼6種結構蛋白，從3′端到5′端依次分別為核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、大蛋白(L)[1]。HN蛋白和F蛋白鑲嵌于脂質包膜上，在病毒入侵宿主細胞的過程中，HN蛋白結合受體后激活F蛋白發(fā)生不可逆的構象改變，拉近病毒包膜與宿主細胞膜的距離最終導致膜融合的發(fā)生[5]。

1 F蛋白

F蛋白屬于I型病毒包膜糖蛋白(N端在胞外，C端在胞內)，從N端到C端分為頭部區(qū)(Head)、軀干部(Stalk)、跨膜區(qū)(Transmembrane region，TM)、尾部區(qū)(Tail)。F蛋白首先以惰性前體蛋白F0存在，相對分子質量約為59×103，成熟的F0蛋白呈以二硫鍵連接的同源三聚體結構。其從側面看表現(xiàn)為圓形、甜甜圈樣(Donut-like appearance)，而從頂部看則為三角形[6]。起初的惰性前體蛋白F0并沒有膜融合活性，需被宿主蛋白酶裂解成兩個亞單位(F1和F2)后才具有融合活性。其中F1位于亞單位的C端，F(xiàn)2位于N端，兩者通過二硫鍵連接[7]。在宿主細胞內負責切割F蛋白的酶主要有弗林(Furin)蛋白酶、成對堿性氨基酸切割酶4(PACE4)和激素原轉換酶6(PC6)等[8]。

F1亞單位的N端有一段高度保守的疏水性區(qū)域，即融合肽(Fusion peptide，F(xiàn)P)，F(xiàn)P主要負責錨定在細胞膜上以啟動膜融合過程。此外F三聚體的融合核心是由兩個七肽重復序列HR1和HR2組成。HR1位于F1亞單位的N末端，與FP的C端相鄰；相反HR2位于C末端，與跨膜區(qū)(TM)的N端相鄰[9-10]。啟動膜融合后，HR1和HR2會發(fā)生構象改變形成一個穩(wěn)定的6卷曲螺旋束(Six helical bundle，6HB)。目前的研究表明HR1和HR2在膜融合啟動前并未結合，而是在膜融合發(fā)生后借助兩者之間強大的親和力才形成了復合體。每一個HR均可以形成α螺旋結構，在HR2內每七個氨基酸就會出現(xiàn)一次亮氨酸或異亮氨酸，所以當 HR2 形成α螺旋以后， 保守的亮氨酸或異亮氨酸均排列在螺旋的同一側形成亮氨酸拉鏈，在副粘病毒中亮氨酸拉鏈對膜融合活性有重要作用[11-12]。

2 HN蛋白

HN蛋白是一種Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(N端在胞內，C端在胞外)，從N端到C端依次為胞質尾區(qū)(Cytoplamic tail，CT)、跨膜區(qū)(TM)、莖部區(qū)和頭部區(qū)。有活性的HN蛋白以同源四聚體的形式存在，C末端的每個單體頭部上有一個六片層β折疊結構域，每一個片層都由4個反向平行 β 鏈構成。單體結構分析頸部與β-1及β-2六片層的相互作用對四聚體的形成至關重要[13-14]HN蛋白四聚體頸部會呈現(xiàn)一個平行的四螺旋束狀結構(Four-helix bound，4HB)，HN頭部區(qū)與頸部4HB上端相互接觸形成廣泛的相互作用界面。HN蛋白頭部區(qū)主要發(fā)揮受體結合活性及神經(jīng)氨酸酶活性，頸部結構域不僅能在CT區(qū)和TM區(qū)的協(xié)助下穩(wěn)定HN蛋白的四聚體結構，而且是激活F蛋白并與F蛋白發(fā)生特異性相互作用的關鍵區(qū)域[15-16]。

HN蛋白的主要功能包括：①受體識別活性：識別易感細胞表面的唾液酸并與之發(fā)生特異性結合；②發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶(NA)活性：增加病毒粒子對細胞的粘附，并在病毒出芽時切割宿主表面的唾液酸以破壞受體活性；③促進F蛋白的膜融合功能：通過識別同源性的F，使其進行一系列構象改變最終導致膜融合[13-14]。

3 HN和F相互作用機制

為了在感染過程中將遺傳物質傳遞給靶細胞，包膜病毒利用其表面特殊的蛋白結合受體并促進其包膜和靶細胞膜的融合[17]。作為副粘病毒科的一種單股負鏈RNA病毒，人副流感病毒3型通常是利用其表面兩種糖蛋白的相互作用來介導病毒的入侵：HN蛋白—特異性識別靶細胞膜表面的唾液酸受體，再利用其神經(jīng)氨酸酶活性切割靶細胞膜表面的唾液酸，增強病毒粒子對靶細胞的粘附；另一種是F蛋白，F(xiàn)蛋白一旦被HN激活就能夠介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，將病毒的遺傳物質傳遞到宿主細胞內。當感受到合適的生化觸發(fā)或是在某種情況下暴露于極端溫度時，F(xiàn)蛋白就會從一種亞穩(wěn)定的前融合狀態(tài)轉變成高度穩(wěn)定的后融合狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)在F蛋白介導的膜融合中HN與特異性受體的結合對膜融合來說是必不可少的，且膜融合過程中HN和F的相互作用也是十分關鍵的[18]。

3.1兩種膜融合模型當前研究表明，副粘病毒表面糖蛋白在膜融合激活和病毒入侵過程中相互作用的模式主要有兩種：⑴夾鉗模型(Clamp model)，HN-F的相互作用在受體沒有結合的時候就發(fā)生了，在膜的表面HN與亞穩(wěn)定的狀態(tài)F蛋白“鉗制”在一起，防止F蛋白過早地被激活。當HN蛋白結合受體后，兩個蛋白分離，從而激活F蛋白發(fā)生構象改變，最終導致膜融合的發(fā)生；(2)破壞模型(Provocateur model)，只有在HN蛋白結合受體以后才會發(fā)生HN-F的相互作用，受體結合后HN蛋白自身構象發(fā)生改變，激活F蛋白，啟動膜融合過程[19]。

3.2HN四聚體頭部的兩種構象為了更多地了解hPIV3包膜糖蛋白構象改變及在病毒表面的空間分配，更好地解釋兩個蛋白的相互作用關系。Gui等[6]利用負染色(Negative-stain)和冷沉淀電子斷層成像(Cryo-electron tomography)技術對未結合受體的hPIV3病毒粒子成像，發(fā)現(xiàn)HN至少存在兩種空間結構模型，第一種是HN四聚化排列，但缺乏與F蛋白的親密接觸，HN蛋白同源四聚體頭部采取一種“頭部下垂”(4-heads dowm)的構象。除此以外，他們還發(fā)現(xiàn)表面密度復雜的區(qū)域所含有的HN采用一種“頭部抬舉”(4-heads up)的形式，與前融合形式的F蛋白三聚體共存，這樣的共存發(fā)生在HN與受體結合之前，支持了之前提到的夾鉗模型[6]。

3.3新的膜融合模型hPIV3是一種重要的呼吸道病原體，之前的研究中就發(fā)現(xiàn)hPIV3 HN蛋白和F蛋白在膜融合激活之前就存在相互作用[20]。Gui等[6]猜想HN對維持F蛋白融合前狀態(tài)有作用，受體的結合將HN轉換成活性模式，以此觸發(fā)并激活F。為了強調受體結合的重要性并闡明HN蛋白和F蛋白在融合過程中是如何相互作用的，在活細胞中使用雙分子熒光互補(BiFC)技術，觀察HN-F在最小擾動條件下的相互作用，進而研究了HN和F介導的膜融合事件在實際過程中發(fā)生的順序。BiFC的結果結合其它關于病毒入侵的研究，Gui等[6]提出了一種關于副粘病毒HN和F如何介導膜融合的模型。在此模型中，HN-F的聯(lián)系發(fā)生在受體結合之前且有助于F蛋白的穩(wěn)定，阻止其過早引發(fā)激活。在活細胞中，HN與受體的結合使得HN-F復合物的合成聚集于融合位點，且一個假定的第二受體結合位點在hPIV3 HN的二聚體交界面形成，直接控制F蛋白激活和與F蛋白的相互作用。在F蛋白最初的激活過程之后，HN和F保持結合狀態(tài)，HN在融合肽插入靶細胞以后依然作用于F。隨著融合過程的發(fā)展，HN-F復合物會分離開。

3.4HN頭部兩種構象與F蛋白不同的相互作用方式電子斷層成像技術提供了hPIV3 HN表面糖蛋白的組織方式。與實驗數(shù)據(jù)比對來看，結構信息能夠初步闡釋與病毒入侵相關的糖蛋白相互作用的特點。許多觀察到的表面特征可以用HN和F已知的晶體學結構來解釋，目前可以確定HN四聚體頭部的兩種構象與F蛋白在細胞表面的分布及不同的相互作用模式[6]。

3.4.1 頭部下垂的HN與F蛋白沒有相互聯(lián)系:在對未結合受體的hPIV3斷層成像中觀察到的一個顯著特征是HN以兩個二聚體形成的四聚體“頭部下垂”的模型存在，并且 F與“頭部下垂”的HN不會發(fā)生聯(lián)系[6]。另外，在這種構象中，沒有唾液酸受體結合位點被調整成面向靶細胞的方向，且HN四個頭部中只有兩個更靠近靶細胞，另兩個被假定為與HN莖部相互作用且無法與靶細胞表面受體接觸[16]。對其他的副粘病毒來說，有實驗數(shù)據(jù)表明NDV上具有兩個活性位點，I類位點同時表現(xiàn)出NA活性和受體結合活性，而位點II只表現(xiàn)出受體結合活性，這兩種位點在X射線晶體結構中也被確證。并且發(fā)現(xiàn)NDV的I類位點結合受體后會導致II類位點的激活并能有效地促進膜融合[21]。Yuan等[16]認為，在與靶細胞表面唾液酸受體相互作用的過程中，HN頭部區(qū)可能會通過頭頸連接區(qū)類似“鉸鏈”的功能調整方向以暴露其他的頭部位點。對于hPIV3來說，Porotto等[22]發(fā)現(xiàn)了HN假定的第二個唾液酸結合位點能調節(jié)HN-HN的二聚化和hPIV3-HN對F蛋白的激活。目前Gui等[6]已經(jīng)觀察到在未結合受體的hPIV3病毒表面 “頭部下垂”的HN不與F蛋白相互作用，HN頭部只有處于抬舉狀態(tài)時才有可能與F發(fā)生關聯(lián)。那么下一步實驗或許應該探討，“頭部下垂”且尚未與F相互作用的HN分子是否可以順利結合到靶細胞表面的唾液酸受體。

3.4.2 頭部抬舉的HN與前融合狀態(tài)的F蛋白三聚體共存:在病毒表面呈現(xiàn)雙層密度的區(qū)域，前融合狀態(tài)的F蛋白三聚體上方存在許多高密度區(qū)域。推斷這個密度區(qū)域可能是HN的單體或二聚體形成的[6]。與晶體結構的結果相比，前期低分辨率的負染色圖像和密度分布的研究發(fā)現(xiàn)，該雙層密度區(qū)域是由于在一些未結合受體的hPIV3粒子表面“頭部抬舉”的HN和F共同存在所導致的[23]。這些發(fā)現(xiàn)也支持了生化和BiFC的數(shù)據(jù)結果：“頭部抬舉”的HN和F在沒有結合到受體時就存在相互聯(lián)系，而且能讓F穩(wěn)定地處于前融合構象中，使其無法輕易被高溫激活[24]。當前的研究中高分辨率的冷凍和負染色數(shù)據(jù)也提供了關于hPIV3表面HN和F關系的構象更多細節(jié)。但目前獲得的數(shù)據(jù)并不能解釋共存狀態(tài)下HN和F相互作用的強弱或這種作用是否具有特異性，也不能說明兩者只是簡單地聚集在相同區(qū)域。

3.5HN的低聚化對膜融合活性的影響大量生化和病毒學數(shù)據(jù)支持了HN在激活F蛋白膜融合過程中的重要作用[17,24-26]。hPIV3及相關副粘病毒HN蛋白的莖部特定氨基酸被認為與F蛋白的激活有關[27]。盡管發(fā)現(xiàn)相關hPIV3 HN莖部氨基酸在延伸模型中可能會暴露并能與附近雙層區(qū)的F蛋白分子相互作用，但是單靠頭部抬舉HN莖部的暴露并不能充分激活F。HN蛋白莖部區(qū)聚合形成四螺旋束結構(4HB)，對于HN結合受體并觸發(fā)F來說是必要的。BiFC數(shù)據(jù)支持了這種觀點， HN和F在受體結合前就形成了聚集簇[24-28]。之前認為，HN轉換到能夠激活F的模式是受體結合介導的，受體結合后HN單體才會聚集為功能性二聚體或四聚體，從而導致F的激活[24]。對于仙臺病毒來說，有人觀察到四聚唾液酸GQ1b神經(jīng)節(jié)苷脂對融合的誘發(fā)遠比二聚唾液酸GD1a充分[29]。同樣，在麻疹病毒無頭H蛋白的膜融合激活的研究中，在特異性莖部突變體存在時，頭部可有可無：莖部需要形成4HB結構來引發(fā)F的充分激活[30]。尼帕病毒受體結合蛋白G在缺乏頭部時能夠激活F蛋白，說明頭部結合受體不是必需的；然而只有一小部分的這樣的蛋白在具有特異性莖部時就可以激活F，且似乎只有這些特異性莖部區(qū)能夠避開結合受體的需要[31]。對于hPIV3來說，發(fā)現(xiàn)影響HN二聚化的突變體依然可以影響F蛋白的激活和膜融合的效率；單體間相互作用的減弱導致膜融合活性降低[24-28]。因此，HN的低聚化特性在調整hPIV3 F蛋白的激活中起作用，且與細胞表面受體相互作用后HN和F的聚集可能會提高HN的四聚化或莖部高階螺旋束結構(4HB)的形成。前融合狀態(tài)的F與頭部向上的HN在未結合受體時就共存，暗示至少觀察到的頭部向上的HN無法通過自己來為激活F提供足夠的刺激[24-28]。此外，就像細胞實驗暗示的，受體結合可能為觸發(fā)F提供必要的激活信號。

“破壞模型”認為，受體結合觸發(fā)HN經(jīng)歷從頭部向下到頭部向上的轉變，導致HN莖部一個能與F相互作用的區(qū)域暴露[17]。如果這種機制存在，頭部向下的HN陣列可能需要在結合受體時被破壞，從而轉變?yōu)轭^部向上的HN構象，這才能與F相互作用或使其激活[13]；然而Gui等[6]觀察到頭部抬舉的HN與F在未結合到受體時就有相互聯(lián)系，這與hPIV3純粹的破壞模型不一致。但經(jīng)歷從頭部向下到頭部向上的轉變后HN是否可以更高效的激活F，及 HN低聚化是否會影響其與受體的親和力？尚需進一步研究加以明確。

3.6膜融合的后續(xù)步驟副流感病毒的膜融合在中性pH下就可以完成，早期的步驟包括：粘附蛋白(HN/H/G)與其相關的細胞表面的受體結合，觸發(fā)HN發(fā)生結構重排，隨后激活F蛋白廣泛的構象變化，最終導致膜融合的發(fā)生。膜融合過程的后續(xù)步驟包括融合孔隙的形成和擴張。雙層膜的融合不是自發(fā)的，只有消耗儲存在亞穩(wěn)定前融合狀態(tài)下F蛋白三聚體中的能量，通過不可逆的構象改變后，副粘病毒才能侵入宿主細胞[31]。 此外，該過程甚至可能需要6個F蛋白進行同步構象改變形成前發(fā)夾中間體(PHI)才能克服膜融合的高能屏障[32]。

起初F蛋白以亞穩(wěn)定狀態(tài)的惰性前體蛋白F0存在時，HR1和HR2由于相距較遠，親和力不強，所以不能夠發(fā)生相互作用引起構象的改變，而此時FP也隱藏在分子結構的內部。當膜融合啟動后，F(xiàn)蛋白發(fā)生不可逆的構象改變，與HR1相鄰的FP暴露到病毒包膜表面并嵌入到宿主細胞膜中。FP是以一定角度的傾斜方式插入到細胞膜中的，這種插入方式與平行或垂直插入到靶細胞膜的方式相比能更有效地破壞脂質雙分子層的穩(wěn)定性，提高膜融合效率[9-10]。膜融合啟動后，HR1和HR2發(fā)生構象改變，3分子HR1和和反向平行的3分子HR2形成一個穩(wěn)定的6HB。位于螺旋的外側的3分子的HR2緊緊纏繞著位于螺旋中心的3分子的HR1。此六螺旋結構在大多數(shù)包膜病毒的膜融合過程中均可觀察到，該構象能進一步拉近F蛋白與細胞膜的距離，最終導致膜融合的發(fā)生[33]。

F蛋白跨膜區(qū)(TM)是形成融合小孔所必需的[34]。融合小孔起初形成時空隙只有1～2 nm，這對于病毒RNA來說實在太小無法通過，隨后由胞質尾區(qū)(CT)來調節(jié)融合小孔的擴張[35-36]。對于PIV5來說，其肌動蛋白能夠阻止孔隙的擴張，這說明細胞骨架可能是影響孔隙擴張的主要障礙[37]。然而目前對細胞孔隙擴張的相關研究較少，但細胞內蛋白質，例如RSV和HeV的Rho GTP酶，已顯示能影響合胞體形成[38-39]。F蛋白的CT端或這些病毒蛋白不明功能的區(qū)域與細胞內蛋白的相互作用，一定程度上會使細胞骨架重排，隨后導致融合小孔的擴張，最終實現(xiàn)病毒侵入宿主細胞及合胞體的形成[40-41]。

4 展望

hPIV3作為呼吸道感染的主要病原體，目前并沒有針對hPIV3的有效藥物，在發(fā)病早期階段使用利巴韋林、干擾素和蛋白酶抑制劑等會有一定療效。各類疫苗也在處于研發(fā)階段，近年來取得了重要進展。然而對人體安全有效的疫苗仍未問世，其主要障礙是對病毒和靶細胞的融合機制尚未明確，所以加深對hPIV3入侵宿主機制的理解是研發(fā)疫苗和藥物的重要環(huán)節(jié)。

目前國內外對hPIV3與靶細胞的融合機制及兩種包膜糖蛋白在融合過程中主要的構象變化及相互作用模型也做出了幾種假設，但目前尚未得出被公眾認同的結論，各種猜想需要得到進一步實驗驗證。

針對hPIV3感染宿主的機制研究為抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)提供了主要的理論基礎，以后應該加強對HN和F在促進膜融合過程中相互作用的理解，這兩種蛋白含有有效中和抗原表位，將HN和F作為主要靶蛋白更有助于亞單位疫苗的研發(fā)。

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2017-08-07)

(本文編輯：唐瀏英)

Researchprogressininteractionmechanismofenvelopedglycoproteinsofhumanparainfluenzavirustype3

JiangJingjing,WangZhiyu

DepartmentofVirology，SchoolofPublicHealth，ShandongUniversity，Jinan250012，China

WangZhiyu，Email:zhiyu.wang@sdu.edu.cn

Human parainfluenza viruses (hPIVs)，a series of single-stranded RNA viruses of Paramyxoviridae，are the main pathogen of respiratory tract infection. hPIV3 is the main cause of lower respiratory tract infection leading to bronchiolitis and pneumonias in young children under the age of six months，and it is the second major pathogen only next to respiratory syncytial virus (RSV). In this paper，we mainly discuss two kinds of virulence-related surface glycoprotein of hPIV3: hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein and fusion protein (F) by briefly introducing the protein structure and physiological functions of HN and F. According to the latest research progress，we focus on the models which have been postulated to explain how F and HN work in concert to bring about membrane fusion.

Parainfluenza virus；HN protein；F protein；Interaction mechanism；Membrane fusion

王志玉，Email：zhiyu.wang@sdu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.020

副流感病毒；血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白；融合蛋白；作用機制；膜融合

國家自然科學基金(81672011)

FundprogramsNational Natural Science Foundation of China (81672011)