自噬對間充質干細胞的生物學作用研究進展

王澤宇 張亮 陳濤 黃澤楠 馮新民

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是源于中胚層的成體干細胞的總稱，目前發(fā)現(xiàn)骨髓、臍帶、脂肪中均存在自身MSCs[1-2]。MSCs可以在體外形成脂肪、軟骨、骨骼、肌肉和皮膚等，因此在組織再生與修復中具有巨大潛力[1-2]。細胞自噬（autophagy）是胞質內生物大分子和細胞器被具有雙層膜的自噬體包裹，并送入溶酶體進行降解的一種過程，廣泛存在于真核細胞生物和哺乳動物[3-4]。

近年來，自噬已成為研究熱點，越來越多的研究表明，自噬是調節(jié)對細胞應激的適應性反應并有助于維持生理條件下細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵過程。本文就自噬在MSCs研究中的進展做一綜述。

一、自噬的定義、分類及主要功能

（一）自噬的定義及分類

自噬是在缺氧、營養(yǎng)剝奪、代謝、氧化應激和蛋白毒性等應激下，由自噬相關基因（autophagy related gene，ATG）調控，細胞經由溶酶體分解細胞器和蛋白等物質的過程[3-4]。在這個過程當中有最重要的2個步驟：首先是胞內的靶向物被膜結構包裹形成自噬小泡；然后所形成的自噬小泡與溶酶體結合，形成自噬溶酶體對胞內靶向物質進行降解。

自噬的分解代謝和降解過程可分為3種不同形式：（1）分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）：這種自噬對細胞器無降解作用，一般只降解胞漿中蛋白質成分，具有高度選擇性，往往在長時間饑餓的條件下出現(xiàn)[4]；（2）微自噬（microautophagy）：通過溶酶體主動吞噬的方式將胞質內的物質直接吞入溶酶體進行降解，在饑餓或雷帕霉素誘導時發(fā)生[5]；（3）巨自噬（macroautophagy）：當外界刺激信號作用到細胞時，細胞內可形成吞噬泡的雙層膜結構，并擴張延伸最后包裹細胞質和部分待降解的細胞器及蛋白質[6]。

（二）自噬的主要功能

自噬的主要功能如下[3-6]：（1）維持細胞穩(wěn)態(tài)：吞噬并降解從而達到更新線粒體和內質網等一些細胞器的目的，并維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定；（2）維持細胞存活：當外界環(huán)境變化時，自噬可以為細胞提供所需的游離脂肪酸、核苷酸、氨基酸等一些可再利用物質，從而適應外界環(huán)境的變化；（3）參與部分組織的重構：自噬掃除細胞內細胞器及某些代謝產物，并幫助細胞重構；（4）誘導細胞死亡：當自噬機制被激活并開啟后可主動引起細胞死亡。

二、自噬在MSCs功能特性維持中的作用

在多種MSCs的增殖、分化及干性基因維持等方面自噬都發(fā)揮著重要調節(jié)作用。哺乳動物的微管相關蛋白輕鏈3（light chain 3，LC3）是酵母菌ATG8的同源蛋白，包含LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ形式，其中LC3-Ⅱ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位在自噬體和自噬溶酶體膜上的蛋白質，其含量多少與自噬泡數(shù)量成正比，是較特異的自噬指標[7]。在MSCs中，在LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ的過程中證實存在自噬的大量激活，并且其激活可能依賴于抗細胞凋亡蛋白Bcl-X1[8]。因此，大量研究致力于各種細胞內外刺激因素誘導的自噬在干細胞干性維持及存活中的作用[9]。

（一）高糖狀態(tài)

由糖尿病和代謝綜合征引起的高血糖會導致血管和器官功能障礙，已成為危害人類健康的主要問題。Zhao等[10]研究證實骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以顯著緩解胰腺INS-1細胞的葡萄糖源性的細胞毒性，但自噬的激活顯著抑制了BMSCs對β細胞的保護作用。此外，臍帶MSCs可能通過誘導受損細胞自噬加速糖尿病患者創(chuàng)面愈合過程[11]。Chang等[12]發(fā)現(xiàn)高糖可以誘導BMSCs衰老，導致細胞數(shù)目減少，從而影響干細胞微環(huán)境的功能使得造血功能受損；同時高糖誘導的BMSCs衰老可以釋放促炎性因子，從而誘發(fā)局部炎癥及組織損傷。

（二）衰老

高糖環(huán)境下培養(yǎng)的BMSCs會出現(xiàn)細胞早衰、基因組不穩(wěn)定及端粒改變，自噬對處于應激狀態(tài)的細胞具有保護作用[12]。通過上調Beclin-1、ATG5及ATG7表達實現(xiàn)的自噬激活，以及增加的LC3-Ⅱ轉化與BMSCs衰老相關；通過3-甲基腺嘌呤抑制自噬可以減少細胞衰老。當細胞衰老時，細胞在形態(tài)上變大變平，最終停止分裂；同時失去干細胞特征，從而影響干細胞的臨床應用[13]。雖然在干細胞衰老過程中明確存在自噬過程，但自噬在干細胞穩(wěn)態(tài)及干性維持上的作用仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)敲除ATG基因會加速細胞衰老，而致癌應激可以通過激活自噬誘導干細胞衰老[14-15]。自噬是一種應激適應反應，可以避免細胞死亡及抑制細胞凋亡，構成可替代的細胞死亡途徑。因此一定范圍的自噬可以預防細胞衰老，而過量的自噬激活則可縮短細胞壽命。

干細胞衰老的潛在分子機制，尤其是與自噬相互疊加的部分仍不明確。細胞周期調節(jié)因子及抑癌因子p53的增加與BMSCs的衰老相關，并且可以調控BMSCs的細胞周期、細胞凋亡及基因穩(wěn)定性[16]。敲除p53基因導致LC3-Ⅱ轉化減少及mTOR表達上調，因此p53基因是BMSCs的體外擴增自噬過程中必不可少的因素[17]。盡管目前細胞衰老方面的研究已取得重要進展，但在細胞壽命研究中的自噬及具體的分子機制仍有待于進一步研究。

（三）氧化應激損傷

為維持干細胞的干性，干細胞通過建立局部低氧微環(huán)境來主動延緩衰老[18]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源是受損的線粒體，可以通過干細胞的線粒體自噬途徑去除ROS[19]。研究表明饑餓及雷帕霉素誘導的自噬可以減少由放射損傷導致的ROS及DNA損傷，從而實現(xiàn)干細胞的干性維持；而抑制自噬將導致ROS集聚及DNA損傷，最終導致干細胞的干性丟失[20]。另外，對于放射損傷對MSCs的影響，研究發(fā)現(xiàn)抑制放射誘導的自噬后，BMSCs凋亡明顯增加；增強放射誘導的自噬后，盡管凋亡比例未下降，但自噬向凋亡的轉化被拮抗，因而自噬可能對BMSCs具有放射保護作用[21]。因此自噬增加可能減少氧化應激等損傷造成的MSCs凋亡，延長干細胞的存活。

（四）低氧

在調節(jié)干細胞存活及維持干細胞干性的細胞外因素中，干細胞微環(huán)境的理化性質如氧張力、滲透壓及pH值對干細胞的生物學行為及分化具有重要影響[22]。低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是細胞適應低氧環(huán)境的關鍵性調節(jié)因子[23]，通過影響血管的形成和功能改善局部微環(huán)境，通過糖酵解途徑調節(jié)O2的利用。

低氧可以通過AMPK/mTOR信號通路激活BMSCs的自噬。在自噬抑制劑3甲基腺嘌呤存在下，干細胞自噬的激活將會導致TUNEL陽性細胞減少，從而出現(xiàn)低氧誘導的凋亡，而雷帕霉素則可促進自噬[8,24-25]。但Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在3甲基腺嘌呤存在下低氧誘導的凋亡增加，而雷帕霉素則可減少自噬，說明自噬可能在低氧誘導的MSCs凋亡中發(fā)揮保護作用；另有研究表明低氧通過自噬及apelin（一種線粒體源性的神經肽）促進BMSCs增殖[27]。以上研究結果不同的原因可能是由于干細胞的部位特異性決定的，如脛骨來源的BMSCs具有更強的干細胞干性基因表面標志Nanog、Oct-4 及Sox2表達，在常氧及低氧狀態(tài)下具有更強的自噬和抗衰老能力[28]。

（五）pH

干細胞微環(huán)境的pH值影響MSCs的增殖、分化及旁分泌活性。生理條件下外周血pH值約為7.35 ～ 7.4，而細胞內液及細胞外液pH值較低，且pH值容易因細胞代謝而改變。細胞糖酵解和氧化代謝增加產生大量碳酸和乳酸，導致細胞外酸中毒，細胞將代謝產生的酸性物質排出細胞外維持細胞內pH值在正常范圍。因此在細胞膜內外出現(xiàn)了pH梯度變化：細胞外pH值低于細胞內pH[29]值。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以通過自噬機制適應酸中毒[30]。雖然細胞外酸中毒可以促進腫瘤干細胞的干細胞表型維持，但局部酸性環(huán)境能夠誘導正常干細胞維持干性未被證實。因此，細胞外酸中毒與MSCs生物學行為的關系仍有待于進一步研究。

酸性微環(huán)境可以調節(jié)MSCs的干性及再生能力。自噬與干細胞的干性特征、細胞衰老及死亡的調節(jié)相關，而酸性環(huán)境可以誘導自噬發(fā)生[31]。Sbrana等[32]在酸性條件下培養(yǎng)MSCs，通過檢測pH6.8的酸性環(huán)境或pH7.4中性環(huán)境下LC3-Ⅱ、p62及Beclin1等典型的自噬標志蛋白的表達來評估BMSCs的自噬，結果發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)環(huán)境中均檢測到BMSCs的自噬，且兩種環(huán)境下無明顯差別，說明自噬并不是MSCs面對酸性微環(huán)境的主要調節(jié)適應機制。

三、自噬在MSCs分化中的作用

成骨細胞系的MSCs通常具備成骨、成軟骨及成脂分化能力。不同局部微環(huán)境（細胞形態(tài)、細胞骨架張力、細胞黏附性及機械或結構細胞性質）可以調節(jié)干細胞向不同譜系細胞分化。低密度干細胞傾向于向成骨細胞分化，高密度細胞使得細胞易凝結并向成脂細胞分化。細胞形態(tài)通過調節(jié)內源性Rho GTP酶（RhoA）活性來調節(jié)成脂—成骨分化轉換，RhoA陰性使MSCs向脂肪細胞轉化，而RhoA陽性則向成骨細胞分化[33]。

自噬在MSCs的分化（尤其是成骨分化）中發(fā)揮重要作用。Nuschke等[34]發(fā)現(xiàn)在未分化的MSCs中存在未退變的自噬泡的集聚及少量自噬轉化，而促進成骨分化則可以使得自噬轉化持續(xù)增加。因此，自噬可能在MSCs的成骨分化調控中發(fā)揮關鍵作用。通過牙髓MSCs的AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、mTOR、蛋白激酶B（Akt）和自噬標記物等基因敲除的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs的成骨分化調控與早期mTOR抑制及Akt/mTOR信號軸的晚期激活有關[35]。特異AT序列結合蛋白2（SATB2）通過上調多能基因及自噬相關基因可以促進BMSCs的成骨分化和骨缺損再生，而多能基因及自噬相關基因又可以激活雷帕霉素信號通路[28]。盡管mTOR信號可能影響MSCs的成骨分化，但雷帕霉素是否可以降低或增加成骨分化的結果存在爭論。雷帕霉素對大鼠BMSCs無自發(fā)的成骨作用，但可以抑制地塞米松誘發(fā)的成骨分化[36]。

在MSCs的成脂分化研究方面，已知再生障礙性貧血患者BMSCs可由雷帕霉素誘導發(fā)生自噬和凋亡，并且明顯促進G1期細胞周期阻滯，從而抑制細胞增殖和降低成脂分化，這些現(xiàn)象的機制或許與雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路從而激活自噬有關[37]。在MSCs早期分化期間改變自噬體平衡的藥物治療可以導致MSCs成脂分化效率的變化，雷帕霉素（自噬激活劑）處理可以抑制脂肪細胞形成，巴弗洛霉素（自噬抑制劑）處理可以加速脂肪積累[34]。

四、自噬在MSCs旁分泌中的作用

MSCs通過自分泌方式分泌的各種生長因子很大程度上可以促進MSCs的增殖和分化潛能。其中，成纖維細胞生長因子（fi broblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可以促進MSCs的增殖，而HGF可以促進MSCs的成脂分化[31]。

研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境可以影響牙髓MSCs促進的血管化功能，其機制可能是自噬促進牙髓骨髓MSCs中的LC3表達，細胞質膜上LC3-Ⅱ增加激活Raf-MEK-ERK信號通路，促使ERK進一步發(fā)生磷酸化，并加速牙髓MSCs旁分泌血管內皮細胞生長因子，從而使得血管內皮細胞生長因子促進內皮細胞發(fā)生血管化，進而促進傷口的愈合[38]。Ni等[39]發(fā)現(xiàn)過表達血管內皮細胞生長因子及Bcl-2，可以通過抑制細胞凋亡及自噬，增強細胞的旁分泌途徑來保護缺血環(huán)境下的MSCs。

五、自噬在其他干細胞中的作用

有研究表明，脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）在一定外界條件下可分化為軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞等。雷帕霉素可通過誘導細胞自噬水平增加明顯提高ADSCs向軟骨細胞的分化能力，并且自噬相關基因Atg5被抑制后ADSCs向軟骨細胞的分化能力顯著下降[40]。另一方面，在臍帶MSCs中自噬可促進CXCR4分泌，通過少量的免疫抑制劑他克莫司及西羅莫司抑制Pl3K/AKt/mTOR信號通路并激活自噬系統(tǒng)。此時，Becline1、Atg5及LC3B自噬相關蛋白表達明顯增加，最終導致CXCR4分泌上調[41]。

六、結語與展望

自噬在MSCs干性維持的作用為更好的理解及維持干細胞的活力指明了新的方向，說明MSCs在組織修復及再生中的應用具有巨大潛力。但對于自噬和MSCs之間的關系及其調控的分子機制仍尚不清楚，有待于進一步研究，而這些研究必將會對MSCs的臨床應用提供重要的價值。

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