2015年以來甜葉菊微繁殖研究與應(yīng)用的發(fā)展

唐玉花，馬龍彪

2015年以來甜葉菊微繁殖研究與應(yīng)用的發(fā)展

唐玉花1，馬龍彪2，3*

（1.甘肅省武威市涼州區(qū)發(fā)放鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，武威733000；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

對(duì)2015年以來刊登的甜葉菊微繁殖/離體繁殖/組織培養(yǎng)方面研究的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，為甜葉菊遺傳保真性、快速繁殖及商用大規(guī)模繁殖提供信息與參考。

甜葉菊；微繁殖/離體繁殖；組織培養(yǎng)；發(fā)展

甜葉菊是自交不親和、蟲媒傳粉的短日照植物。甜葉菊是由種子進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模的栽培種植，但傳統(tǒng)培養(yǎng)是困難的。由于種子生命力弱、發(fā)芽率低是限制大規(guī)模栽培的因素之一。營(yíng)養(yǎng)繁殖也受其單株的個(gè)體數(shù)量低的限制，低效無(wú)性繁殖法不符合目前商用栽培繁殖需求。因此，體外繁殖是一個(gè)很有前途的替代方案來解決這個(gè)問題，因此組織培養(yǎng)、微繁殖是甜葉菊大規(guī)模快速繁殖的唯一選擇，甜葉菊芽尖或腋芽培養(yǎng)的微繁殖可獲得遺傳穩(wěn)定、真正純種的后代。然而，目前微繁殖芽數(shù)低且生產(chǎn)成本高。因此各學(xué)者開展了提高甜葉菊繁殖系數(shù)、降低生產(chǎn)成本的研究。

1 不同基質(zhì)對(duì)甜葉菊愈傷組織的誘導(dǎo)、芽增殖及生根的影響

1.12,4-D、IBA、NAA、IAA、BAP、GA3、KIN、2iP

MZ Karim等進(jìn)行了甜葉菊葉組培生產(chǎn)甜菊糖苷（St）試驗(yàn)。葉片誘導(dǎo)愈傷組織，在MS+2.0 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中愈傷組織最好，呈脆弱、綠色；在MS+6.0 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中的愈傷組織最低。甜葉菊葉片誘導(dǎo)愈傷組織IBA表現(xiàn)效果較好，但NAA效果差。葉外植體可作為愈傷組織生產(chǎn)的最佳材料。1.0 mg/L BAP愈傷組織形成芽效果較好，觀察到健康的和最高的芽數(shù)；8.0 mg/L BAP成芽最低。最佳的芽生根誘導(dǎo)是在MS+2.0 mg/ L IBA培養(yǎng)基中，NAA有效，但I(xiàn)AA效果最差。經(jīng)過煉苗，在田間95%的植株存活，所有的植株都是健康的、無(wú)病的、狀況非常好。用此方法，大量的甜菊植物一年四季均可生產(chǎn)，可用于St商用生產(chǎn)。田間收獲的成熟葉經(jīng)HPLC分析，樣品中St的含量是9.6%[1]。

B Yücesan等在體外研究中，均采用種子萌發(fā)產(chǎn)生的母株進(jìn)行腋芽再生。節(jié)點(diǎn)外植體置于再生培養(yǎng)基，改良的MS培養(yǎng)基（含有0.1～0.5mg/L不同濃度的IAA）。再生芽生根成功后，轉(zhuǎn)移到溫室煉苗。在60d內(nèi)有可能從一個(gè)單一的節(jié)點(diǎn)獲得16個(gè)小苗（10cm）。直接萌發(fā)或腋芽再生的所有苗轉(zhuǎn)移到大田（試管外），4個(gè)月后收獲。與常規(guī)苗相比，體外培養(yǎng)的甜葉菊平均芽較長(zhǎng)（54.5：44.4）。采用RP-HPLC測(cè)定甜菊糖（SGs）含量，在體外植株共有16%的SGs，其中11.7%是萊鮑迪苷A（Reb A）[2]。B Yücesan等又研究了甜葉菊MS基本培養(yǎng)基有效的微繁殖方案，以期開發(fā)為商業(yè)使用。節(jié)段培養(yǎng)再生芽，培養(yǎng)3周后所有的處理每個(gè)外植體都產(chǎn)生兩個(gè)芽，不過高濃度KIN和BAP（1.0或2.0mg/L）誘導(dǎo)的愈傷組織更多。在MS+0.25mg/L IAA培養(yǎng)基完成了生根培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后每個(gè)芽產(chǎn)生8.1個(gè)根。再生苗在便攜式溫室煉苗3周，再生植株和種子幼苗轉(zhuǎn)移到大田16周，其植株葉SGs含量沒有差異。Reb A含量為4.7%～5.0%（w/w），而St含量為6.4%～6.9%（w/w）。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期和開花期無(wú)差異。此研究成本效益好，可實(shí)現(xiàn)甜葉菊大田體外高效大規(guī)模生產(chǎn)栽培[3]。B Yücesan等在另一項(xiàng)研究中，再生芽形成6周，隨機(jī)選擇體外發(fā)芽幼苗的節(jié)點(diǎn)在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)（添加或不添加0.1～2.0mg/L 6-BAP或KIN）。結(jié)果，所有的處理對(duì)芽誘導(dǎo)是有效的，培養(yǎng)3周后每個(gè)外植體平均產(chǎn)生兩個(gè)芽，隨后間隔3周接種到MS培養(yǎng)基中，所有節(jié)點(diǎn)的再生芽轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基（添加或不添加0.25或0.50mg/L IAA、IBA、NAA）培養(yǎng)3周進(jìn)行生根。IAA對(duì)生根更有效，每個(gè)芽生7.6個(gè)根，生根率為100%。所有的再生根（根長(zhǎng)13.5cm）株盆栽并在溫室煉苗2周，然后轉(zhuǎn)移到大田14周存活率高＞99%。同樣，來自種子發(fā)芽8齡的盆栽幼苗也轉(zhuǎn)移到同一大田。再生苗和種子苗在營(yíng)養(yǎng)后期和開花期的形態(tài)、產(chǎn)量和SGs成分沒有顯著差異。表明使用節(jié)點(diǎn)外植體的無(wú)性繁殖對(duì)于高優(yōu)質(zhì)芽的生產(chǎn)（Reb A含量11.7%w/w）是有效的[4]。

M Tomaszewska-Sowa等的研究，用無(wú)菌單節(jié)莖段在激素合成基質(zhì)中培養(yǎng)得到了很多的芽，再經(jīng)過伸長(zhǎng)和生根的過程。含0.5mg/dm3BAP的培養(yǎng)條件芽增殖率最高，而在0.5mg/dm3GA3培養(yǎng)條件莖的長(zhǎng)度、芽的葉片數(shù)和葉片大小最好；在0.5mg/dm3IBA基質(zhì)中生根過程得到強(qiáng)化，此種激素生根數(shù)最大，且根最長(zhǎng)。制備的微體苗置溫室中煉苗，煉苗階段是在灌注25%鹽溶液MS中進(jìn)行的，與蒸餾水比，產(chǎn)量增加了46%～70%[5]。

A Yadav等采用RAPD標(biāo)記監(jiān)測(cè)甜葉菊體細(xì)胞無(wú)性系變異。在MS+BAP 2.0mg/L（EM4）培養(yǎng)基中，節(jié)點(diǎn)外植體在4.7±0.20d最大芽誘導(dǎo)98%±2%；莖尖外植體7.1±0.34d誘導(dǎo)74%±2.45%。再生芽在MS+0.3 mg/L BAP+0.3 mg/L KIN+0.1 mg/L NAA+15 mg/L PEG培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d，最高可產(chǎn)生40.5±0.26個(gè)芽；在1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中7.4±0.26d可生根/生芽21.2±0.3個(gè)。生根芽被單獨(dú)分離，在溫室硬化。使用RAPD引物對(duì)甜葉菊硬化植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選。共有24個(gè)RAPD引物共產(chǎn)生82條明顯的可得條帶，每對(duì)引物平均3.4條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物平均100～1100 bp；RAPD引物條帶數(shù)1～7。微繁殖植株RAPD圖譜是單態(tài)的與母株類似，證實(shí)其遺傳是穩(wěn)定的[6]。

A Yadav等又為開發(fā)有效的和可重復(fù)的可再生的大規(guī)模增殖方案進(jìn)行了試驗(yàn)。莖尖和節(jié)段作為外植體。當(dāng)外植體用0.1%HgCl2處理3min，0.2%多菌靈和0.2%鏈霉素處理45min，節(jié)外植體生存率是100%。節(jié)點(diǎn)和莖尖外植體效果最好的培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/L BAP，節(jié)點(diǎn)和莖尖外植體表現(xiàn)最大的不定芽誘導(dǎo)率，分別為4.7d 98.0%、7.1d 74.0%。單獨(dú)使用BAP對(duì)甜葉菊無(wú)菌培養(yǎng)是更好的，可替代細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的不同組合；節(jié)點(diǎn)和莖尖外植體再生芽，MS+0.3 mg/L BAP+0.3mg/L KIN+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基是最好的，培養(yǎng)30d可得34.9個(gè)芽/外植體；生根，1/2MS+0.5mg/L NAA生根效果最好，7.4d每個(gè)芽可生根21.2個(gè)，最大生根率90% ±7.75%。在沒有激素的培養(yǎng)基中生根不健康。生根的單個(gè)芽體轉(zhuǎn)移到塑料袋（沙子、土壤和蚯蚓堆肥的比例為1∶1∶1），存活率達(dá)100%。硬化的植株被轉(zhuǎn)移到大田中[7]。

J Madhavan提出了甜葉菊節(jié)點(diǎn)外植體體外增殖改良的方案。研究了實(shí)驗(yàn)室級(jí)尿素梯度對(duì)節(jié)段外植體多芽誘導(dǎo)的影響。最初節(jié)點(diǎn)外植體在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周以促進(jìn)腋芽突破基。進(jìn)一步，在MS+BAP 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L（添加和不添加尿素5.0 mg/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)40d，結(jié)果，添加尿素的單個(gè)節(jié)段外植體生產(chǎn)最多的芽44.56個(gè)，不添加尿素的為22.44個(gè)。產(chǎn)生的芽數(shù)量差異顯著，這些芽在MS+NAA 4.0 mg/L培養(yǎng)基容易生根。在這些植株中主要和次要硬化是成功的。在微繁殖苗中沒有明顯的形態(tài)異常苗。遺傳分析顯示這些植株遺傳是一致的。本方案的優(yōu)點(diǎn)是多芽誘導(dǎo)、生根和硬化的全過程在6個(gè)月內(nèi)完成[8]。

M Kumari等通過甜葉菊直接和間接器官的葉和節(jié)點(diǎn)外植體離體繁殖方案來開發(fā)生產(chǎn)高價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)行體內(nèi)抑菌試驗(yàn)和體外植株提取試驗(yàn)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合證明，葉外植體好于單一愈傷組織和直接芽增殖。KIN 1.5mg/L+IAA 1.5mg/L處理均獲得最佳的愈傷結(jié)果（85.5%±0.33%）。KIN 2.5mg/L+IAA 1.5mg/L處理的愈傷組織的芽增殖數(shù)量最大（5.3±0.3），芽最長(zhǎng)9.03±0.14 cm；KIN 1.5mg/L+BAP 2.5mg/L處理葉外植體的增殖芽數(shù)最多（8.6±0.33），芽最長(zhǎng)5±0.11cm。愈傷組織的體外再生芽次生代謝產(chǎn)物（St：0.451± 0.001mg/g；Reb A：0.131±0.005 mg/g）較高。也證明了較好的抗菌活性，所測(cè)試細(xì)菌最大抑菌區(qū)：B.subtilis（13.6±0.3 mm）、S.aureus（12.3±0.33 mm）、P.fluorescence（8.6±0.3 mm）及E.coli（10.3±0.1 mm）[9]。

EJ Naranjo研究評(píng)估了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同組合（2,4-D、IAA、IBA、2iP和玉米素）對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育和誘導(dǎo)的影響。腺嘌呤和椰子水也添加到含有混合鹽和谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基（MS）。2,4-D 18.09μM和N6-異戊烯基腺嘌呤（2iP）7.38μM的組合每個(gè)外植體產(chǎn)生細(xì)胞胚的數(shù)量最多，具有明確的特征?；蛐捅憩F(xiàn)出顯著的胚性反應(yīng)效應(yīng)。在“SRQ-93”基因型，實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞胚的形成和發(fā)展，而基因型“Bertoni”和“Morita II”只分別產(chǎn)生胚性和非胚性愈傷組織。在含GA3（0.29μM）和活性炭的再生培養(yǎng)基獲得了轉(zhuǎn)化苗[10]。

NRA Rashid以莖尖和節(jié)段作為外植體誘導(dǎo)再生芽，莖尖在MS+1.0mg/L KIN培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，表現(xiàn)出最高的芽增殖。2周后MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基芽伸長(zhǎng)和生根被成功地優(yōu)化了。培養(yǎng)3周后隨著IBA濃度的增加根的誘導(dǎo)逐漸下降。相比之下，0.25 mg/L IBA促進(jìn)根的形成效果最好，誘導(dǎo)的根很短而硬且多毛。在臨時(shí)浸沒式生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行甜葉菊芽大量繁殖，表現(xiàn)出快速與連續(xù)生產(chǎn)體外甜菊苗很大的潛力[11]。MA Ramírez-Mosqueda等用自動(dòng)臨時(shí)浸泡的接受者建立商用甜葉菊微繁殖方案，達(dá)到低成本和自動(dòng)化的方式實(shí)現(xiàn)大量繁殖過程。結(jié)果顯示，每個(gè)外植體每8h在20mL的1.0mg/L BA中浸泡2min，最高芽數(shù)為18.37。在沒有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（PGR）的MS培養(yǎng)基上獲得100%的生根芽，90%的再生植株在溫室條件下成功地?zé)捗纭Ｔ偕仓瓯憩F(xiàn)出較低的遺傳變異率（10.4%）。本方案可應(yīng)用在甜葉菊商業(yè)微繁殖[12]。

1.2聚乙二醇（PEG）、脯氨酸、甲醇

Gupta P等進(jìn)行了甜葉菊經(jīng)脯氨酸和PEG處理其愈傷組織和懸浮培養(yǎng)增加SGs產(chǎn)量的試驗(yàn)。從甜葉菊葉片獲得黃綠色緊湊的愈傷組織，在MS培養(yǎng)基上添加2.0mg/L NAA和2.5～10mM脯氨酸與2.5%～10% PEG，在24±1℃和22.4μmol/（m2·s）的光強(qiáng)度（白色熒光管16 h）進(jìn)行繼代培養(yǎng)2周。在5.0mM脯氨酸和5% PEG的濃度，愈傷組織和懸浮培養(yǎng)生物量增加了，繼續(xù)增加濃度，它們卻降低了。在用誘導(dǎo)因素處理/不處理兩種情況下對(duì)愈傷組織（第15天收集）和懸浮培養(yǎng)（第10和15天收集）的SGs含量進(jìn)一步做HPLC分析，SGs的生產(chǎn)顯著增強(qiáng)了。在愈傷組織，在添加7.5mM脯氨酸和5%PEG時(shí)，SGs含量分別從0.27%（對(duì)照）增加到1.09%和1.83%，約是對(duì)照的4.0和7.0倍。然而，在懸浮培養(yǎng)的情況下，相同的脯氨酸和PEG濃度使SGs含量在第10天分別從1.36（對(duì)照）增加到5.03%和6.38%，是對(duì)照的3.7倍和4.7倍[13]。M El-Zaid進(jìn)行了7個(gè)甜葉菊基因型的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征及過氧化物酶同工酶的生化遺傳變異研究。組織培養(yǎng)技術(shù)利用不同濃度的植物激素產(chǎn)生更多的芽來確定各基因型的愈傷組織誘導(dǎo)和再生的最佳培養(yǎng)基，測(cè)定了干旱脅迫下不同濃度的PEG對(duì)所有基因型的可培養(yǎng)愈傷組織效果等[14]。

MJ álvarez-Robles等為商業(yè)利益找到增加次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的方法，用不同濃度的甲醇進(jìn)行了甜葉菊體外芽培養(yǎng)。從植株提取物分析可知添加1.5%（v/v）甲醇培養(yǎng)基導(dǎo)致最高的抗氧化能力，甜葉菊芽總可溶性酚、黃酮類化合物、羥基肉桂酸化合物與抗氧化能力之間關(guān)系密切，也同樣提高。在0.1%（v/v）甲醇培養(yǎng)芽再生SGs達(dá)到最高的水平，約為對(duì)照的2倍多。結(jié)果表明甲醇代謝途徑的差動(dòng)敏感度導(dǎo)致甜葉菊葉的SGs和酚類物質(zhì)的積累。甲醇為生物活性化合物生產(chǎn)開辟了寶貴的新途徑[15]。

1.3纖維素酶、離析酶、崩潰酶、果膠酶、玉米素、蔗糖、甘露醇

M Lopez-Arellano等為建立高效可繁殖的甜葉菊原生質(zhì)體再生方案，研究了酶的類型和濃度、滲透壓、培養(yǎng)時(shí)間、植物材料類型和年齡等因素。使用酶混合物：2%纖維素酶+1.5%（w/v）離析酶+0.2%（w/v）崩潰酶+ 0.1%（w/v）果膠酶在0.5甘露醇+2.5mM CaCl2.2H2O和5mM MES在pH值5.8培養(yǎng)基中從體外生長(zhǎng)的4周齡植株葉成功地分離出原生質(zhì)體。在酶液中4h黑暗培養(yǎng)獲得了約（8.4±0.40）×106g鮮重存活率98.8%±1.39%的原生質(zhì)體?；畹脑|(zhì)體通過16%蔗糖溶液離心收集，經(jīng)瓊脂糖珠或淺層液體培養(yǎng)技術(shù)，每5×105mL密度的原生質(zhì)體在KM8P培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L玉米素+0.15M蔗糖+0.3M甘露醇培養(yǎng)。原生質(zhì)體在24h內(nèi)細(xì)胞壁再生，培養(yǎng)后2～3d開始第一細(xì)胞分裂，4周內(nèi)觀察到小菌落的形成。逐漸加入較低滲透壓的新鮮培養(yǎng)基，有利于細(xì)胞分裂。與液體培養(yǎng)相比，瓊脂糖珠培養(yǎng)提高分裂頻率近1.5倍，且再生植板率分別為13%和9.1%，成活率分別為23.5%、14.8%。轉(zhuǎn)移到MS+1.0mg/L BA，單獨(dú)或與NAA或與2，4-D 0.1 mg/L組合培養(yǎng)基，經(jīng)8周的胚胎發(fā)育，愈傷組織的原生質(zhì)體產(chǎn)生完整的植株。再生植株在土壤中存活，形態(tài)和生長(zhǎng)性狀均正常。該方案可能利用原生質(zhì)體的再生體系通過體細(xì)胞雜交、體細(xì)胞無(wú)性系變異和遺傳工程對(duì)甜葉菊進(jìn)行改良[16]。

1.4ALG、CH、PEC、YE、MeJA、SA、CHI、杏膠

M Bayraktar等進(jìn)行了甜葉菊微繁殖不抑制植物生長(zhǎng)、可提高植株次生代謝產(chǎn)物含量的研究，甜葉菊節(jié)點(diǎn)外植體在木本植物培養(yǎng)基（WPM）[海藻酸（ALG）、水解酪蛋白（CH）、果膠（PEC）、酵母提取物（YE）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）或殼聚糖（CHI）]上培養(yǎng)。觀察了含有不同成分WPM培養(yǎng)基再生芽情況：含有1.0 g/L YE（最高芽數(shù)）；100μM CHI（芽長(zhǎng)、節(jié)數(shù)、葉數(shù)）；0.5 g/L CH（葉長(zhǎng)）和1.0 g/L ALG（莖粗）。在WPM（0.5、1.0或2.0 g/L PEC，1.0 g/L YE，或50μM CHI及對(duì)照）根系再生頻率達(dá)到100%；WPM含有0.5 g/L PEC的根數(shù)最多，WPM含有1.0 g/L YE的根長(zhǎng)最長(zhǎng)；100μM CHI處理的生物量積累最高。據(jù)HPLC測(cè)定結(jié)果，除200μM CHI，100或200μM MeJA和200μM SA處理，剩余的誘導(dǎo)處理均比對(duì)照提高了St的生產(chǎn)。0.5 g/L ALG和2.0 g/L YE處理的體外苗St產(chǎn)量分別從1.56 mg/g干重增加到14.69和14.54 mg/g；僅在0.5 g/L ALG處理觀察到Reb A為0.55mg/g干重。田間生長(zhǎng)植株的St含量為15.06 mg/g干重[17]。

植物組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)和形態(tài)可通過少量的一些有機(jī)元素而改善，除了天然來源的碳，有機(jī)添加劑可能含有天然維生素、酚類、纖維、激素和蛋白質(zhì)。S Khorsha等測(cè)定了添加2.0～6.0 g/L杏膠對(duì)胡蘿卜、甜葉菊和葡萄3種植物的再生能力和生長(zhǎng)速率的影響。結(jié)果杏膠大大減少了甜葉菊生根時(shí)間，微扦插苗接種在杏膠6.0 g/L的培養(yǎng)基在不到一周的時(shí)間完成生根（只有6.5d），而對(duì)照植株完成生根至少10d。在杏膠的培養(yǎng)基根的長(zhǎng)度也增加，但是，不同處理根的數(shù)量并沒有顯著差異。添加杏膠的培養(yǎng)基試管苗長(zhǎng)度和葉減少了，而葉面積和側(cè)枝增強(qiáng)了。看來較低濃度的杏膠（2.0和4.0 g/L）導(dǎo)致更好的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。對(duì)葉色素沉著也有類似的趨勢(shì)，因此，2.0g/L杏膠對(duì)葉色素沉著和暗綠色的生產(chǎn)更有效。在商用組織培養(yǎng)方案高度推薦使用膠，但需進(jìn)一步開發(fā)研究植物衍生膠作為植物組織培養(yǎng)基質(zhì)替代碳資源[18]。

1.5瓊脂、TDZ、KH2PO4、MgSO4、活性炭

H Lata等通過評(píng)價(jià)酚類化合物和自由基清除及與母株對(duì)比，來研究體外再生方案的可靠性。含有腋芽的節(jié)段進(jìn)行體外繁殖，外植體接種于MS+3.0%（w/v）蔗糖+0.8%（w/v）瓊脂+1.008M TDZ（噻苯?。┡囵B(yǎng)基誘導(dǎo)芽，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到無(wú)任何調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基生根。在土壤中成功建立了全根試管苗，在氣候控制室內(nèi)生長(zhǎng)條件下，長(zhǎng)至成熟成活率達(dá)95%。母株和組織培養(yǎng)的植株葉片樣品在營(yíng)養(yǎng)高峰期（開花前）收獲。結(jié)果表明，體外繁殖株（IVPP）與母株（MP）相比堪稱完美。測(cè)定平均酚，IVPP：107.70±3.95mg GAE/g干重（GAE，沒食子酸當(dāng)量），MP：108.18±1.59mg GAE/g干重；黃酮類化合物，IVPP：50.80±2.81mg QE/g干重（QE，槲皮素當(dāng)量），MP：53.36±0.46mg QE/g干重）和DPPH與細(xì)胞抗氧化（CAA）性能。這些結(jié)果，確定組織培養(yǎng)無(wú)性系的保真度可繁育甜葉菊植株[19]。

AR Modi等介紹了甜葉菊高效微繁殖方案。在體外芽增殖不同的培養(yǎng)試驗(yàn)中，無(wú)激素液體培養(yǎng)基最適合。當(dāng)單節(jié)外植體在改良MS+1.0%蔗糖+0.7%瓊脂培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)4周后，每個(gè)芽的最高節(jié)點(diǎn)數(shù)是5.4個(gè)，芽長(zhǎng)是4.76cm。在1/2MS大量元素+MS微量元素+170 mg/L KH2PO4+185mg/L MgSO4塑料生長(zhǎng)容器中最高增殖率為9.56%。RAPD標(biāo)記分析體外培養(yǎng)的植株保真度良好，沒有顯示任何體細(xì)胞無(wú)性系變異[20]。

A Mehrafarin等研究了MS和1/2MS培養(yǎng)基加IBA、NAA和活性炭對(duì)根誘導(dǎo)的影響。增殖結(jié)果，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平無(wú)顯著差異。生根數(shù)據(jù)表明，對(duì)葉長(zhǎng)、地上部干重、根鮮重，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之間差異顯著。生長(zhǎng)在無(wú)炭基質(zhì)的試管苗生物量高于添加2.0mg活性炭的基質(zhì)，在1/2MS+0.2mg/L IBA+2.0 mg/L活性炭培養(yǎng)基中生物量最高（8.18%）。表明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可影響芽的增殖和生根。甜葉菊的微繁殖可提高改變大量元素濃度，增加活性碳?？傊?，1/2MS+0.2 mg/L IBA+2.0 mg/L活性炭對(duì)St含量最優(yōu)[21]。

1.6納米粒子ZnO

IV Alvarado-Orea等評(píng)價(jià)了SGs在甜葉菊根積累情況。培養(yǎng)20d后最大生物量和St產(chǎn)量分別為10.24mg/L和4.0mg/g，在5×10-6（T1）和15×10-6（T2）濃度的納米氧化鋅（NPs ZnO）下增加了，St和Reb A分別是對(duì)照（St 2.7mg/g、Reb A 6.1 mg/g）的1.5、4.7倍和4.7、6.4倍[22]。R Javed等研究了不同濃度（0、0.1、1.0、10、100或1000mg/L）的氧化鋅（ZnO）納米粒子（34nm大?。?duì)組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的甜葉菊芽的生長(zhǎng)參數(shù)、Reb A與St和抗氧化活性的影響。在1.0mg/L ZnO納米粒子的濃度形成的芽比例最高（89.6%），表明該濃度ZnO納米粒子處理比其它處理或無(wú)ZnO納米粒子的處理有良好的影響。此外，HPLC結(jié)果說明在1.0 mg/L納米ZnO的氧化脅迫下微繁殖芽的SGs顯著增強(qiáng)（幾乎是對(duì)照的2倍）。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步肯定了隨著氧化壓力的提升和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，DPPH清除活性、總抗氧化能力、總還原力、總黃酮和總酚含量在提高。然而，當(dāng)超過1.0 mg/L濃度的ZnO納米粒子閾值和低于1000 mg/L后，抗ZnO性、次生代謝產(chǎn)物的形成和生理參數(shù)出現(xiàn)突然下降。這是評(píng)價(jià)ZnO納米粒子用于甜葉菊有利的和不利影響的第一項(xiàng)研究[23]。

1.7Eriksson（ER）基質(zhì)、White基質(zhì)、Gamborg（B5）基質(zhì)、Nitsch基質(zhì)

J Mehta的不同培養(yǎng)基研究結(jié)果，甜葉菊莖尖、節(jié)段作為外植體，在不同的基質(zhì)，如Eriksson（ER）基質(zhì)、White基質(zhì)、Gamborg（B5）基質(zhì)、Nitsch基質(zhì)，添加不同濃度的BAP。這些基質(zhì)中，ER+3.0 mg/L BAP培養(yǎng)基獲得最好的結(jié)果，在White+1.0mg/L BAP培養(yǎng)基得到令人滿意的結(jié)果，在B5+3.0mg/L BAP培養(yǎng)基增殖質(zhì)量好，Nitsch+2.0 mg/L BAP培養(yǎng)基增殖質(zhì)量較好[24]。

1.8光照的影響

熒光燈是各種植物的離體培養(yǎng)最常用的光源。然而，還有其他的光源，如發(fā)光二極管（LED），已被證明是體外培養(yǎng)更有效的。MA Ramírez-Mosqueda等評(píng)估了LED對(duì)體外形態(tài)發(fā)生、芽增殖、生長(zhǎng)和生根的影響。為此，測(cè)試了5種不同來源的16 h光周期：熒光燈（Fl）、白色LED（W）、紅色LED（R）、藍(lán)色LED（B）和藍(lán)紅LED組合（B/R，1：1）。與Fl光相比，R LED增殖率較高，雖然其芽的長(zhǎng)度較低；在B/R LED的芽最長(zhǎng)。在生根過程中，LED并沒有提高芽的生根，但提高了光合色素含量，從而促進(jìn)了試管苗的煉苗進(jìn)程[25]。B Yücesan等試驗(yàn)結(jié)果2000～3000lx光照的種子發(fā)芽率較高，2d內(nèi)達(dá)到50%的芽率，幾乎所有的種子在1周內(nèi)發(fā)芽。幼苗在溫室條件下（25℃，配備側(cè)白冷熒光燈，3000klx）進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育12周，再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[2]。TFO Silva等比較了在體外和在體內(nèi)生長(zhǎng)的甜葉菊形態(tài)解剖橫切面根，體外系統(tǒng)是在黑暗和光照條件及滾瓶系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)基用來維持根的生長(zhǎng)，比較了甜葉菊的根生長(zhǎng)在體外的橫截面結(jié)構(gòu)和形態(tài)差異（與對(duì)照比）；在培養(yǎng)基中維持的根，其發(fā)育受基質(zhì)透氣、糖濃度和光照程度的影響。GC-MS和TLC證實(shí)了甜葉菊體外生長(zhǎng)的根具有產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力，與野生植株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物類似[26]。

2 農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根

植物次生代謝產(chǎn)物綠原酸及其衍生物（CADs）是對(duì)健康有益的生物活性物質(zhì)。為了提高其產(chǎn)量，以發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和甜葉菊無(wú)菌葉片為材料，選取生長(zhǎng)迅速的毛狀根，接種于1/2MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，建立了毛狀根液體培養(yǎng)技術(shù)體系。并優(yōu)化了生產(chǎn)CADs的培養(yǎng)條件。進(jìn)一步的基因檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的rolB和rolC基因已成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)至甜葉菊基因組中，毛狀根為農(nóng)桿菌侵染甜葉菊葉片所致。分析表明，（3-咖啡酰奎寧酸（3-CQA），3，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-CQA）和4，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-CQA）是毛根中主要的CADs。選擇8個(gè)快速生長(zhǎng)的單根，其中，T3的CADs收益率最高；添加40 g/L蔗糖的B5培養(yǎng)基比其他培養(yǎng)基更適于生產(chǎn)CADs，毛狀根收獲的濕重和干重分別為17.93和2.34 mg/100mL，3-CQA、3,5-CQA和4,5-CQA含量分別為39.44、57.72和2.48 mg/g，總綠原酸類化合物的產(chǎn)量高達(dá)233.54 mg/100mL，比未優(yōu)化條件前的總產(chǎn)量提高了66.39%；在最佳培養(yǎng)條件下，這3個(gè)化合物的總含量達(dá)到105.58mg/g，總收率為234.40mg/100mL。通過甜葉菊毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類化合物具有很好的應(yīng)用前景[27-28]。

L Calderón-Gabriel等為了提高SGs的生產(chǎn)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化建立毛狀根培養(yǎng)基，評(píng)價(jià)了3個(gè)農(nóng)桿菌菌株LB9402、K599和AR4對(duì)甜葉菊毛狀根的誘導(dǎo)影響。轉(zhuǎn)化過程是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的兩種材料：下胚軸外植體和全苗。感染后1周開始出現(xiàn)毛狀根。這些根從外植體分離和獨(dú)立培養(yǎng)在1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行繁殖。LB9402菌株對(duì)甜葉菊表現(xiàn)出最大的誘導(dǎo)力，與其他菌株比7d和15d后大量毛狀根被誘導(dǎo)[29]。Z Michalecwarzecha等也進(jìn)行了類似研究，用甜葉菊植株的葉和節(jié)間在不同的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行兩株農(nóng)桿菌ATCC 15384和LBA 9402轉(zhuǎn)化。觀察到毛狀根的形成，外植體轉(zhuǎn)化率取決于外植體的類型、接種時(shí)間和接種濃度。接種菌株LBA9402的試管內(nèi)和試管外的離體外植體比接種菌株ATCC15384的轉(zhuǎn)化率高。在光照條件下，毛狀根的生長(zhǎng)明顯下降[30]。H Pandey等研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜葉菊毛狀根培養(yǎng)，探索關(guān)于低熱量的二萜苷St尚未發(fā)現(xiàn)的生物合成潛力。在光照和黑暗條件下研究了4個(gè)穩(wěn)定的毛狀根體細(xì)胞無(wú)性系的生長(zhǎng)情況，結(jié)果在黑暗表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)。在光照下，其中兩個(gè)毛狀根體細(xì)胞無(wú)性系顯示較高的光合色素積累。顯然，在光照下，SRA4毛狀根體細(xì)胞無(wú)性系有獨(dú)特的St合成力，其它的無(wú)性系沒有。RT-PCR定量分析表明UGT85C2基因與毛狀根的光合作用能力相結(jié)合在調(diào)節(jié)甜葉菊的生物合成途徑中起決定性作用[31]。

Madhumita Kumari等研究了甜葉菊葉片和莖段外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)毛狀根的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)。毛狀根生長(zhǎng)在MS基質(zhì)（溫度25°C，16 h光照）得到最佳的St生產(chǎn)。不同強(qiáng)度的MS和B5的基質(zhì)中，全MS培養(yǎng)基生產(chǎn)的St為0.412±0.008mg/g，Reb A為0.100±0.008mg/g；在B5基質(zhì)中毛狀根生產(chǎn)的St為0.383±0.002 mg/g，Reb A為0.098±0.005 mg/g。毛狀根在25℃±2℃下生長(zhǎng)最大，隨著溫度的升高，毛狀根生長(zhǎng)下降。溫度增加對(duì)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)沒有太大的影響，St含量分別為：25℃0.425±0.08 mg/g，28℃0.415±0.08 mg/g，31℃0.386±0.02 mg/g，當(dāng)溫度增加到35℃，St含量迅速下降（0.090±0.02 mg/g），Reb A完全檢測(cè)不到[32]。

3 結(jié)束語(yǔ)

我國(guó)作為世界第一甜葉菊種植大國(guó)、世界第一甜菊糖生產(chǎn)大國(guó)、世界第一甜葉菊出口大國(guó)。但是，我國(guó)甜葉菊產(chǎn)業(yè)大而不強(qiáng)，存在問題不少，亟待整體提升[33]。關(guān)于甜葉菊微繁殖/組織培養(yǎng)的研究全球正在如火如荼地進(jìn)行。但是在查找到的2015年以來的約40篇文獻(xiàn)中，僅有1篇屬中文的，也僅有兩篇屬中國(guó)人的研究，我們這方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及國(guó)外同行，是過時(shí)了還是沒得研究了？

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The Development and Application of Stevia Micropropagation since 2015

TANG Yu-hua1,MA Long-biao2,3*
(1.Agricutural Technology Service Station of Fafang Town People's Government,Liangzhou District,Wuwei,Gansu 733000;2.Crop Academy of Heilongjiang University/Sugar Beet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080; 3.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080)

The literatures published since 2015 about micropropagation/tissue culture research of stevia were reviewed and summarized,so as to provide information and references for genetic fidelity,rapid propagation,and commercial large-scale propagation in stevia.

stevia;micropropagation;tissue culture;development

S566.9；Q81

：B

：1007－2624（2017）03－0063－06

10.13570/j.cnki.scc.2017.03.023

2017-02-19

唐玉花（1979-），女，甘肅武威人，助理農(nóng)藝師，從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

馬龍彪（1965-），男，黑龍江哈爾濱人，副研究員，碩士，主要從事甜菜生物技術(shù)的研究。E-mail：caasmlb@163.com，通信地址黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)學(xué)府路號(hào)黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院