糖尿病勃起功能障礙動(dòng)物模型的制備

曾 杰 劉 瑤 焦薇薇 許明賀 王 杰綜述 王傳航審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院

·綜 述·

糖尿病勃起功能障礙動(dòng)物模型的制備

曾 杰1劉 瑤2焦薇薇1許明賀1王 杰1綜述 王傳航1審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院

流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中ED的發(fā)病率為19.5%～75.2%[1,2]。隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，糖尿病勃起功能障礙（DMED）的發(fā)病率也日漸增高，預(yù)計(jì)我國到2025年DMED患者會(huì)達(dá)到4000萬[3]。對疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究可以指導(dǎo)臨床診療，而制備合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)研究的前提。本文針對DMED動(dòng)物模型的制備進(jìn)行綜述。

一、造模動(dòng)物的選擇

綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?jīng)費(fèi)狀況、動(dòng)物自身特點(diǎn)、飼養(yǎng)環(huán)境和與人體結(jié)構(gòu)的相似度等因素，選用恰當(dāng)?shù)脑炷?dòng)物可以確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可信性。實(shí)踐中常選擇大鼠、小鼠、兔、豬等動(dòng)物，少數(shù)情況下也選擇靈長類動(dòng)物如猴[4]。

在DMED的造模中，嚙齒類動(dòng)物因?yàn)閮r(jià)格較低和技術(shù)成熟等原因故較多的被選用[5]。其中，大鼠盆腔及陰莖組織的神經(jīng)反射、血管走向以及相關(guān)受體分布等與人類有較強(qiáng)相似度，而且抗感染能力強(qiáng)和繁殖周期短[6]，故在DMED的造模中使用最多。小鼠因體型小易捕捉，發(fā)育迅速，性成熟早，尾部血管豐富，在DMED的分子病因?qū)W機(jī)制研究中選用較多[7]。

與其他常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，豬和人類在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理等方面具有更大的相似度，與人的基因純合度為95%，人工選育的小型豬由于性格溫順而易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，特別是隨著現(xiàn)代動(dòng)物保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)和“3R原則[即減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）]”的實(shí)行，小型豬在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有更大優(yōu)勢[8]。有研究采用高脂高糖飼料喂廣西巴馬小型豬，半年后有50%小型豬產(chǎn)生糖尿病，1年后DMED的總成模率為13%[9]。

兔大小適宜、方便管理，其陰莖結(jié)構(gòu)和人很相似，尤其是在海綿體張力的神經(jīng)與非神經(jīng)因素方面[10]，且沒有陰莖骨，海綿體組織相對豐富。陳國強(qiáng)等[11]從兔的耳緣靜脈注射四氧嘧啶，成功建立糖尿病動(dòng)物模型，再通過測定海綿體內(nèi)壓，成功建立DMED動(dòng)物模型。Pereira等[12]采取相同的方式建立家兔DMED模型，通過病理和免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)生ED的機(jī)制是血管結(jié)構(gòu)變化，陰莖血液供應(yīng)減少。

嚙齒類動(dòng)物雖然廣泛用于建立人類疾病動(dòng)物模型，但是由于存在巨大的種屬差異，很多在動(dòng)物研發(fā)中證明對鼠有效的藥物卻對人無效。靈長動(dòng)物從生物學(xué)上來說是人類的近親，相比其他動(dòng)物模型，靈長類動(dòng)物可更好地復(fù)制人類疾病[13]。但是由于數(shù)量相對少、費(fèi)用昂貴等因素，目前缺少使用非人類靈長類動(dòng)物建立DMED模型的報(bào)道。

二、DM動(dòng)物模型的建立

（一）1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）動(dòng)物模型

T1DM動(dòng)物模型的建立多基于破壞動(dòng)物胰島，方式有藥物誘導(dǎo)和手術(shù)切除胰腺[14]。手術(shù)切除胰腺對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害較嚴(yán)重，操作有一定難度，批量造模困難。藥物誘導(dǎo)簡便易操作，常用的藥物有鏈脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（alloxan,ALX）。STZ和ALX對動(dòng)物胰島β細(xì)胞有特異的破壞作用，可減少或終止動(dòng)物胰島素分泌，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患糖尿病。

STZ是一種誘導(dǎo)DNA雙鍵斷裂的強(qiáng)烷基化藥劑，可抑制葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)，影響葡萄糖激酶功能，損傷胰島β細(xì)胞。據(jù)報(bào)道[15]，成年雄性長尾猴靜脈注射STZ,兩個(gè)月后再次注射該藥,定期靜脈抽血可發(fā)現(xiàn)長尾猴血糖水平明顯升高，內(nèi)源性胰島素明顯降低。由于大鼠和小鼠以及同種動(dòng)物不同品系之間對STZ敏感性不同，藥物注射劑量和給藥方式等也有差異。有報(bào)道稱，一次性給小鼠大劑量注射STZ（100mg/kg）[16]，大鼠注射STZ（55～65mg/kg）[17]可導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞壞死，建立無炎癥性T1DM模型。也有研究報(bào)道，小鼠小劑量（40mg/kg）連續(xù)腹腔注射STZ，可引發(fā)自身免疫性損害，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫性T1DM動(dòng)物模型[18]。

ALX對胰島β細(xì)胞具有特殊的破壞作用，可通過產(chǎn)生超氧自由基終止胰島素的分泌。以兔為造模動(dòng)物，可采用耳緣靜脈注射ALX的方式，連續(xù)2次小劑量（首次按80mg/kg，24h后按照120mg/kg）給藥比1次大劑量（150mg/kg）給藥成模率更高（80%/20%），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率更低（10%/70%）[19]。梁沛余等[20]認(rèn)為多次ALX給藥法建立糖尿病大鼠模型時(shí)，第1次大鼠腹腔注射ALX 100 mg/kg，24h后補(bǔ)注相同劑量是最佳給藥時(shí)間和劑量。丁利等制備T1DM小鼠模型時(shí)[21]，利用ALX腹腔兩次注射法，首次劑量為120mg/kg，24h后再次注射80mg/kg，可防止小鼠低血糖的發(fā)生，降低死亡率。

（二）2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）動(dòng)物模型

在T2DM模型動(dòng)物的構(gòu)建中，為避免大劑量注射STZ導(dǎo)致T1DM和動(dòng)物血糖過低而死亡，可采用煙酰胺（NAA）預(yù)先15min注射保護(hù)胰島β細(xì)胞，再給STZ破壞，能夠建立成模率高、病死率低、癥狀明顯的T2DM模型[22,23]。大鼠可預(yù)先注射NAA100～200mg/kg，小鼠可預(yù)先注射NAA120～240mg/kg，有助于清除氧自由基，減輕STZ導(dǎo)致的胰島細(xì)胞氧化損害。

飲食聯(lián)合藥物干預(yù)也是建立T2DM動(dòng)物的重要手段，樂嶺等[24]利用高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠，8周后大鼠體質(zhì)量增加，腹腔脂肪明顯增多，以小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)甘油三酯、游離脂肪酸和胰島素抵抗指數(shù)升高，高血糖與胰島素抵抗均出現(xiàn)，與人類T2DM病理生理特點(diǎn)相似。在利用小鼠[25]、獼猴[26]造模時(shí)，給予高脂高糖飲食飼養(yǎng)后，再使用藥物制備DM模型，也能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗，符合人類T2DM的臨床特點(diǎn)和病理特征。因此，這種造模方法簡便可行，重復(fù)性好，是研究T2DM機(jī)制和并發(fā)癥較為理想的模型。

在實(shí)驗(yàn)性DM動(dòng)物模型之外，近年也有自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型應(yīng)用于相關(guān)研究。例如OLETF大鼠、GK大鼠、db/db小鼠、黑線倉鼠等，具有慢性DM病程、多食、輕度肥胖、胰腺增生等特點(diǎn)，早期可出現(xiàn)胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，繼而胰島功能逐步減退，很接近人類T2DM。而且，OLETF大鼠具有由于代謝紊亂而致的血管內(nèi)皮功能障礙的病理表現(xiàn)[27]，血管內(nèi)皮功能障礙是ED的病理基礎(chǔ)之一，因此利用自發(fā)性T2DM動(dòng)物建立2型糖尿病勃起功能障礙模型是值得研究的方向。

近年來基因編輯技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，通過對基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾，可快速構(gòu)建動(dòng)物模型。利用基因編輯技術(shù)，研究者已經(jīng)成功制備T2DM動(dòng)物模型[28]。然而，目前基因工程動(dòng)物模型有成本較高、單基因模擬、繁殖時(shí)間長等缺點(diǎn)，也可能因脫靶效應(yīng)而引發(fā)生物安全風(fēng)險(xiǎn)，仍需隨著基因工程技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，建立科學(xué)安全的多基因修飾的動(dòng)物模型。

三、勃起功能的評估

DM造模成功后，下一步需評估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的勃起功能。誘導(dǎo)陰莖勃起的方法有血管活性藥物海綿體注射法、負(fù)壓吸引法、電刺激法、可視性性興奮刺激法等，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中常使用阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)、電刺激法以及模擬自然狀態(tài)下交配行為等。

阿撲嗎啡（APO）作為一種非選擇性的中樞多巴胺受體激動(dòng)劑，可通過激動(dòng)D1、D2樣受體，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生陰莖勃起。研究者對DM兔予APO皮下注射,觀察和記錄勃起狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)DM兔表現(xiàn)出顯著的勃起功能抑制[29]。DM大鼠成模后進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)，隨著時(shí)間延長，勃起次數(shù)和勃起率逐漸降低，從中可篩選出DMED大鼠進(jìn)行研究[30]。此法評價(jià)陰莖勃起的判定標(biāo)準(zhǔn)具有一定主觀性，對于動(dòng)物同樣的表現(xiàn)，不同的實(shí)驗(yàn)者可能會(huì)產(chǎn)生判斷上的差異。

運(yùn)用電刺激動(dòng)物陰莖海綿體神經(jīng)誘發(fā)勃起，再通過換能器讀取陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP），ICP可直接反映陰莖的勃起功能，因此該法較為客觀準(zhǔn)確。用電刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)后測量ICP及平均頸動(dòng)脈壓（MAP），對比正常組和T2DM組大鼠的ICP和MAP，可發(fā)現(xiàn)T2DM組的ICP明顯低于正常組[31]。通過改良ICP測量方法，選擇陰莖腳作為穿刺部位，利用倒刺狀穿刺針進(jìn)行穿刺，可使進(jìn)針穩(wěn)定精準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)測定ICP成功率可達(dá)100%[32]。利用電刺激盆神經(jīng)，也可以誘發(fā)兔[11]、狗[33]等動(dòng)物陰莖勃起，評價(jià)其勃起功能。電刺激法在國外是評價(jià)陰莖勃起功能的標(biāo)準(zhǔn)方法，穩(wěn)定準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，故應(yīng)用較為廣泛[34,35]，但也有操作方法復(fù)雜、對動(dòng)物創(chuàng)傷大、電刺激參數(shù)難以把握等不足。

評價(jià)動(dòng)物勃起功能也可采用交配實(shí)驗(yàn)，通過以藥物誘導(dǎo)雌鼠發(fā)情，隨后將雌鼠和STZ注射后的糖尿病雄鼠放在一起，觀察記錄雄鼠乘騎、插入、射精次數(shù)及射精潛伏期、射精后間隔來評價(jià)勃起功能[36]。馬凱偉等[37]將DM大鼠分為APO組、西地那非組和模型組，分別予以相應(yīng)藥物干預(yù)后用發(fā)情雌鼠與之配對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模動(dòng)物經(jīng)過藥物刺激后的狀態(tài)難以準(zhǔn)確體現(xiàn)勃起功能，相比之下，由發(fā)情雌鼠誘導(dǎo)更可能激發(fā)出模型雄鼠陰莖的確切勃起。該法易受環(huán)境影響，有的勃起功能正常的動(dòng)物可能因與雌性動(dòng)物同籠受驚，缺乏交配主動(dòng)性，從而會(huì)導(dǎo)致假陽性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

四、小結(jié)

目前，在人類身上進(jìn)行性功能的相關(guān)研究受到倫理等多方因素的制約，因此研究者需要設(shè)計(jì)各種DMED的動(dòng)物模型，研究并闡明糖尿病導(dǎo)致ED的發(fā)病機(jī)制、藥物的藥理作用等。在DMED實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，嚙齒類動(dòng)物模型的建立比較成熟，在較大程度上取代其他動(dòng)物成為DMED的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｗ詈?，探索建立更加符合人類生理病理特點(diǎn)的糖尿病動(dòng)物模型，提高評價(jià)勃起功能的方法的準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害，降低實(shí)驗(yàn)成本，提高成模率，是今后研究工作的著力點(diǎn)之一。

致謝：本課題受國家自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：81673978）

糖尿病; 勃起功能障礙; 疾病模型, 動(dòng)物

1 Mazzilli R, Elia J, Delfino M, et al. Clin Ter 2015; 166(5): e317-e320 2015; 166(5): 317-320

2 中國2型糖尿病勃起功能障礙多中心調(diào)查協(xié)作組. 中華內(nèi)分泌代謝雜志 2005; 21(4): 348-352

3 向林, 向光大. 藥品評價(jià) 2016; 13(3): 32-35, 63

4 劉晟, 蘇子慧, 艾昭東, 等. 中國組織工程研究與臨床康復(fù) 2009; 13(50): 9917-9923

5 Wu C, Kovac JR. Expert Opin Drug Discov 2016; 11(2): 185-196

6 潘衛(wèi)兵, 曹石金, 謝禮仁, 等. 海南醫(yī)學(xué) 2015; 26(5): 629-631

7 Pan F, You J, Liu Y, et al. Mol Genet Genomics 2016; 291(6): 2215-2224

8 張賀, 王承利, 王洋, 等. 中國畜牧獸醫(yī) 2012; 39(7): 263-266

9 張永斌, 鄒移海, 劉曉秋, 等. 廣東醫(yī)學(xué) 2010; 31(9): 1094-1096

10 Bischoff E. Int J Impot Res 2001;13(3):146-148

11 陳國強(qiáng), 白文俊, 孔雷, 等. 中國男科學(xué)雜志 2005; 19(1): 11-13

12 Pereira VA, Abidu-Figueiredo M, Pereira-Sampaio MA, et al. Int Braz J Urol 2013; 39(3): 424-431

13 薛麗香, 張鳳珠, 孫瑞娟, 等. 中國科學(xué): 生命科學(xué) 2014; 44(9): 851-860

14 Graham ML, Schuurman HJ. Eur J Pharmacol 2015; 759: 221-230

15 Kavanagh K,Flynn DM,Nelson C, et al. J Pharmacol Toxicol Methods 2011;63(3): 296-303

16 劉曉云, 張文, 李衛(wèi)平, 等. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)2017; 22(2): 132-138

17 尤傳靜, 吳強(qiáng), 孫大林, 等. 中國男科學(xué)雜志 2016; 30(4): 7-12

18 楊巍, 羅春元, 于春雷, 等. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)?醫(yī)學(xué)版 2006; 32(3): 432-435, 封3

19 孟建波, 康勝群, 康素嫻, 等. 河北醫(yī)藥 2009; 31(1): 19-20

20 梁沛余, 尹磊晶, 華欠桑多, 等. 青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2015; 36(4): 276-279

21 丁利, 宋冰, 張浩強(qiáng). 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2017; 27(3): 7-12

22 翁琰, 奚苗苗, 朱艷榮, 等. 陜西醫(yī)學(xué)雜志 2013; 42(12): 1571-1573, 1578

23 Manoka S, Sungthong B, Sato H, et al. Nat Prod Commun 2016; 11(6): 757-761

24 樂嶺, 陳璐璐. 微循環(huán)學(xué)雜志 2013; 23(2): 7-9, 封2, 插1

25 Kang S, Kim CH, Jung H, et al. Neuropharmacology 2016; 113(PtA): 467-479

26 Lu SY, Qi SD, Zhao Y, et al. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2015; 123(1): 19-26

27 陳婧, 易瑋, 許能貴, 等. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2015; 32(1): 178-182

28 Fernández AM, Kim JK, Yakar S, et al. Genes Dev 2001; 15(15): 1926-1934

29 趙禹, 李迎新, 王明久, 等. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2015; 12(6): 14-17

30 潘衛(wèi)兵, 曹石金, 謝禮仁, 等. 海南醫(yī)學(xué) 2015; 26(5): 629-631

31 桂士良, 崔大偉, 騰飛, 等. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2016; 37(1): 16-19

32 吳子云, 何書華, 張濤, 等. 中國臨床解剖學(xué)雜志 2013; 31(2): 192-195

33 邱秀光, 趙升田, 孫曉明, 等. 山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2000; 38(2): 136-138

34 Das ND, Yin GN, Choi MJ, et al. J Sex Med 2016; 13(11):1618-1628

35 Facio FN Jr,Facio MF,Spessoto LF, et al. Int J Impot Res 2016; 28(6): 221-227

36 Escrig A, Marin R, Abreu P, et al. Biol Reprod 2002; 66(1): 185-189

37 馬凱偉, 宋國宏, 張秋梅, 等. 疑難病雜志 2017; 16(1): 72-74

（2017-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.017

R 587.1; R 698.1