八寶丹處理肺腺癌細胞A549和SPCA-1對順鉑化療敏感性的影響*

成 瑜 李洪倫

1 青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 煙臺 264000；2 青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院影像中心

?

八寶丹處理肺腺癌細胞A549和SPCA-1對順鉑化療敏感性的影響*

成 瑜1李洪倫2

1 青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 煙臺 264000；2 青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院影像中心

目的 探討八寶丹處理人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系對順鉑(DDP)抗腫瘤化療敏感性影響。方法 收集人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系進行不同處理，隨機分為對照組(空白)、DDP組(4 uM)、(八寶丹+DDP)組(0.75 mg/kg+4 uM)，處理3周，采用MTT法檢測細胞增殖能力；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標記測定(TUNEL)法檢測細胞凋亡率，采用transwell檢測細胞遷移能力。結(jié)果 與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞增殖能力明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞增殖能力無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞凋亡明顯增加(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.001)。結(jié)論 (八寶丹+DDP)可以增加腫瘤細胞的凋亡，降低腫瘤細胞的增殖，減少A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目，增加腫瘤細胞的DDP抗腫瘤敏感性。

肺腺癌；八寶丹；順鉑；化療敏感性

腫瘤目前仍是嚴重威脅人類健康的疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織( WHO)統(tǒng)計，2008年全球有1240萬人被新檢查出患有癌癥，760萬人死于癌癥．順鉑是第一代鉑類抗腫瘤藥物，具有抗癌譜廣、作用機制獨特、利于臨床聯(lián)合用藥等特點．在臨床上順鉑對肺癌、胃癌、頭頸部腫瘤、骨肉瘤等實體腫瘤的治療取得了很好的效果[1-2]。但是順鉑在治療過程中具有副作用多、毒性大等缺點，因此尋找高效低毒的腫瘤化療增敏劑以增強順鉑的化療效果，提高患者的生存率是一項重要的課題。八寶丹具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛的功效，輔助抗菌、調(diào)節(jié)機體免疫功能[3-4]，長期服用可以減輕化療藥物的毒副作用。而將其用于人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系對DDP化療敏感性的研究并不多見，本研究通過采用八寶丹處理人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系從而觀察八寶丹對DDP在肺腺癌A549和SPCA-1細胞系中化療作用的影響，證實八寶丹在抗腫瘤治療中能提高對DDP化療敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 A549細胞系，SPCA-1細胞(上海華瑞生物科技有限公提供)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，96孔板細胞培養(yǎng)板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)；細胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，PBS磷酸鉀緩沖液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)，DMSO，TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit(Vazyme，A112-02) ，DAPI(碧云天)。八寶丹膠囊(廈門中藥廠有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z10940006，0.75 mg/kg)，順鉑(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20043888，4 uM),其余為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗分組及處理 收集肺腺癌細胞A549和SPCA-1，根據(jù)處理的藥物不同，DDP單藥及八寶丹聯(lián)合DDP進行處理，隨機分為對照組(空白)、DDP組(4 uM)、(八寶丹+DDP)組(0.75 mg/kg+4 uM)，分別進行相應(yīng)的處理。

1.3 儀器 酶標儀(Thermo Fisher Scientific生產(chǎn)，型號：multiscan MK3)；恒溫細胞培養(yǎng)箱(Thermo HERACELL150i)；倒置生物顯微鏡(OPTEC BDS200-PH)；Transwell細胞培養(yǎng)板(Corning 3422)；倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41,U-CTR30-2)；細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific, HERACELL150i)。

1.4 Transwell檢測細胞遷移能力[5]取對數(shù)生長期的細胞，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸,計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×106/mL個細胞，加入100 uL無血清DMEM培養(yǎng)基細胞懸液，加入Transwell小室上室，在下室加入600 uL完全培養(yǎng)基。在37℃,5%CO2孵育24小時后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌一次，結(jié)晶紫染色10min，PBS洗滌一次，檢測細胞是否穿過小孔，如有穿過終止其他實驗組，并拍照統(tǒng)計。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力[6]取同一批分離的心肌微血管內(nèi)皮細胞，接種于24孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔。按1.2和1.3方法進行分組及造模。復(fù)氧結(jié)束后，加20 μL MTT培養(yǎng)4 h，待結(jié)晶物溶解，采用酶標儀在波長492 nm處檢測各組的吸光度(A)值作為細胞增殖能力。

1.6 TUNEL檢測細胞凋亡[7]收集活細胞，按照TUNEL試劑盒的說明書進行操作，制備好后在熒光顯微鏡下進行觀察，綠色熒光為細胞凋亡。采用DAPI對細胞核進行染色，對呈藍色熒光每張選取10個視野進行計數(shù)，試驗組的計數(shù)為80個視野，統(tǒng)計內(nèi)皮細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞增殖能力的結(jié)果 具體見表1，由表1可知與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞增殖能力明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞增殖能力沒有明顯差異(P>0.05)。

表1 MTT法檢測細胞增殖能力的結(jié)果±s，OD值)

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 細胞凋亡的結(jié)果 具體結(jié)果見圖1為A549和SPCA-1的細胞凋亡圖。由圖1可知與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞凋亡均明顯增加(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。

2.3 細胞遷移結(jié)果 A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目見圖2和表2，由圖2和表2可知與對照組比較，DDP組和(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.01)；與DDP組比較，(八寶丹+DDP)組的A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目明顯降低(P<0.001)。

分組A549SPCA?1對照組135．6±20．5253．3±25．6DPP組106．3±22．3?123．7±26．3?(八寶丹+DDP)組20．0±5．9?#45．3±12．1?#

注：與對照組比較，*P<0.001；與DDP組比較，#P<0.001。

3 討論

八寶丹的主要成分是牛黃、蛇膽、羚羊角、珍珠、三七、麝香等。藥理學(xué)研究表明三七可增強免疫活性、保肝利膽、抗炎消腫、緩解各種疼痛[8]；牛黃可調(diào)節(jié)腫瘤患者的免疫機能、誘發(fā)細胞凋亡[9]；蛇膽、羚羊角、珍珠、麝香可改善血液循環(huán)，具有抗氧化及抗炎作用[10]。有研究[11，12]顯示惡性腫瘤患者在化療的過程中長期服用八寶丹可以減少化療藥物的毒副作用，延長患者的生存時間。但是將其應(yīng)用于人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系對順鉑化療敏感性的研究并不多見，而且八寶丹是否可以起到降低順鉑化療敏感性的作用，也是本研究需要研究的內(nèi)容。

順鉑是臨床上用于治療惡性腫瘤的一線藥物，其作用機制是通過直接作用于腫瘤細胞的DNA，破壞腫瘤細胞的DNA，從而抑制腫瘤細胞的增殖。八寶丹是一種中成藥，可以多靶點、整體調(diào)節(jié)患者機體，在一定程度上可以降低鉑類藥物的毒副作用。有研究[13]報道中藥及其組方制劑可以對鉑類藥物的毒副作用起到預(yù)防和減輕的作用，而且其中部分中藥可以增強鉑類藥物抗腫瘤的效果。而關(guān)于八寶丹與順鉑的聯(lián)合能否增強順鉑的化療效果，國內(nèi)尚未見報道。有研究認為多種中藥可以對腫瘤細胞的增殖有抑制作用，對腫瘤細胞有一定的殺傷作用，并對順鉑的耐藥可起到一定的逆轉(zhuǎn)作用[14]，使腫瘤的耐藥細胞迅速凋亡，提高順鉑的藥效，并減少對患者的毒副作用。

本研究通過八寶丹聯(lián)合順鉑對人肺腺癌A549和SPCA-1細胞系的處理，分別對順鉑、八寶丹+順鉑對人肺腺癌A549和SPCA-1細胞的凋亡、細胞增殖及A549和SPCA-1的細胞遷移情況進行了分析，結(jié)果顯示A549的細胞增殖能力明顯高于SPCA-1細胞增殖能力，但是八寶丹+順鉑處理后A549和SPCA-1細胞的增殖能力顯著低于對照組，但與順鉑處理組的腫瘤細胞無明顯差異；通過八寶丹+順鉑處理后A549和SPCA-1細胞的凋亡較順鉑單藥組明顯增加；經(jīng)過八寶丹+DDP處理的A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目均要比順鉑處理的少。結(jié)果表明經(jīng)八寶丹處理后的腫瘤細胞增殖能力降低，凋亡增加，細胞遷移數(shù)目減少。可見八寶丹能增強DDP化療敏感性，提高順鉑的化療效果。

綜上所述，八寶丹+DDP可以增加癌細胞的凋亡，降低A549和SPCA-1細胞遷移數(shù)目，增強腫瘤細胞的DDP化療敏感性。

[1] McKeage M J．Comparative adverse effect profiles of platinum drugs[J]．Drug Saf，1995，13(4):228-244．

[2] Weiss R B，Christian M C.New cisplatin analogs in development-a review[J]Drugs，1993，46(3):360-377．

[3] 溫海東,呂軍,劉俊,等.八寶丹聯(lián)合α1腎上腺素能受體阻滯劑治療IIIB型慢性前列腺炎的臨床研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,25(9):964-966.

[4] 沈美蓉,裴彬,李仲平.八寶丹膠囊治療黃疽型病毒性肝炎臨床研究[J].河北中醫(yī),2012,34(4):492-494.

[5] 郭雋馥，王艷杰，苗蘭英等.四君子丸含藥血清對人肺腺癌SPCA1細胞凋亡及Caspase-3/8/9表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥2015年第26卷第6):1293-1295.

[6] 夏明,童建華,高坦鵬,等.曲馬多聯(lián)合順鉑對人肺腺癌細胞A549侵襲和遷移的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2015,31(4):391-394.

[7] 何進喜,宋旭梅,于亮等.在順鉑耐藥的A549 / DDP人肺腺癌細胞中乙醛脫氫酶表達增加[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(5):625-629.

[8] 楊振橘.三七藥理作用及真?zhèn)舞b別探討[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育.2016,14(8):64-65.

[9] 張宇靜，夏晶，仇佳思，等.牛黃中膽汁酸的藥理作用及定量分析方法研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志2016,43(2):268-273.

[10]吳皓,李鴻,祁鑫,等.八寶丹對結(jié)腸癌荷瘤小鼠的血、脾和骨髓中的髓系抑制性細胞的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學(xué)報),2014,29(2):568-570.

[11] 耿冬梅,張良明,隋銘華.八寶丹膠囊輔助晚期腫瘤化療的研究[J].山西醫(yī)藥雜志,2010,39(6):562-564.

[12] 朱憲軍，張學(xué)德.八寶丹防治腫瘤化療毒副作用的臨床觀察[J].中國民間療法.2006，14(5):45-46.

[13] 劉暢,錢彥方,胡京紅,等.益氣養(yǎng)陰除結(jié)方聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細胞生長及凋亡的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,38(12):823-830.

[14] 王理鋒,黃曉慶.黃芪總苷對肺腺癌SPCA-1細胞增殖的抑制作用[J].中國藥房,26(25):3502-3504.

Effect on sensitivity to cisplatin after Babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cells A549 and SPCA-1

CHENG Yu1LI Honglun2

1 Department of Medical Imaging,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University,Yantai,264000,P.R.China 2 Department of Medical Oncology,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University

Objective To study the babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cell line A549 and line SPCA-1 to cisplatin (DDP) chemotherapy sensitivity.Methods Collected human lung adenocarcinoma A549 and SPCA-1 cell lines for different treatment,were randomly divided to control group (or not),DDP group (4 UM),babaodan DDP group (0.75 mg/kg+4 UM),treatment was 3 weeks,used MTT assay to detect the ability of cell proliferation,used terminal deoxynucleotidyl transfer enzyme mediated D UTP nick end labeling determination (TUNEL) method to detect apoptosis rate, used Transwell assay to detect the ability of cell migration.Results Compared with the control group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of babaodan+DDP group had no significant difference (P>0.05).And compared to the control group,the DDP group and babaodan+DDP group of A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.05).And compared to the control group,A549 and SPC-A-1 cell migration number of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cell migration number decreased significantly (P<0.001).Conclusion Babaodan DDP can increase the apoptosis of cancer cells,reduces the proliferation of cancer cells,reduces cells and the number of migrated of the A549 and SPC-A-1, and enhances the chemotheropy sensitivity of DDP.

lung adenocarcinoma;babaodan;cisplatin;chemotheropy sensitivity

煙臺市發(fā)展計劃項目(2012092)

李洪倫，Email:liubaodong123@yeah.net

R734.2

A

1001-9510(2016)06-0414-04

2016-06-12)