卵巢黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在自然流產(chǎn)大鼠發(fā)病中的作用

寇連翠 駱倩倩 時(shí) 彥 李紅星 張洪芹

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 煙臺(tái) 264003；2 東營(yíng)市人民醫(yī)院胸心外科；3 濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

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·論著·

卵巢黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在自然流產(chǎn)大鼠發(fā)病中的作用

寇連翠1,2駱倩倩3時(shí) 彥1李紅星1張洪芹1

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 煙臺(tái) 264003；2 東營(yíng)市人民醫(yī)院胸心外科；3 濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

目的 通過(guò)觀(guān)察kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在卵巢黃體中的表達(dá)變化，探討kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在自然流產(chǎn)發(fā)病中的作用。方法 以溴隱亭構(gòu)建自然流產(chǎn)大鼠模型，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定檢測(cè)血清中孕酮(P)、雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)的水平，蘇木精-伊紅(H-E)染色觀(guān)察卵巢中黃體的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測(cè)卵巢黃體中kisspeptin/kiss1r的表達(dá)變化。結(jié)果 與正常妊娠組相比，流產(chǎn)組大鼠的流產(chǎn)率明顯增加，血清中P、E2水平明顯降低，而LH水平明顯升高。H-E染色觀(guān)察流產(chǎn)組大鼠卵巢中黃體體積明顯減小，黃體中毛細(xì)血管的數(shù)量明顯下降，卵巢表達(dá)的kisspeptin/kiss1r的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。結(jié)論 在流產(chǎn)模型中卵巢黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)通過(guò)改變機(jī)體的激素水平，發(fā)揮其調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為進(jìn)一步研究流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

kisspeptins；黃體；自然流產(chǎn)

自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科一種常見(jiàn)病、高發(fā)病，由于其病因不明，臨床上對(duì)其診斷和治療存在較多難點(diǎn)。近年來(lái)，眾多學(xué)者對(duì)該疾病的可能病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究。目前研究表明kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)可能與自然流產(chǎn)密切相關(guān)[1]，但機(jī)理不清。本文通過(guò)溴隱亭誘導(dǎo)形成大鼠流產(chǎn)模型研究kisspeptin/kiss1r在卵巢黃體中的表達(dá)變化，以探討kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在自然流產(chǎn)發(fā)病中的作用，為臨床治療流產(chǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 12周齡雌性Wistar大鼠購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，ELISA試劑盒(廈門(mén)慧嘉生物)，蘇木精(索來(lái)寶)，免疫組化試劑盒(中山金橋)，DAB試劑盒(康為世紀(jì))，anti-kisspeptin/kiss1r抗體(Bioss)。

1.2 方法

1.2.1 流產(chǎn)大鼠模型的構(gòu)建 選用12周齡健康、未生產(chǎn)的雌性Wistar大鼠，適應(yīng)1周后，于晚7時(shí)按照雄∶雌=1∶2比例合籠，次日9時(shí)檢查陰栓和陰道涂片，陰道涂片中有大量精子出現(xiàn)定為孕1 d，選出24只孕鼠用于實(shí)驗(yàn)。將孕鼠隨機(jī)分為正常妊娠組12只和流產(chǎn)組12只。正常妊娠組：懷孕12 d；流產(chǎn)組：于孕6～8 d每天腹腔注射溴隱亭0.3 mg/kg，連續(xù)3 d。孕12 d時(shí)，大鼠以4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，心臟取血。然后行4%多聚甲醛進(jìn)行心內(nèi)灌流固定，打開(kāi)腹腔觀(guān)察妊娠結(jié)局及流產(chǎn)鼠數(shù)、胎仔數(shù)，并取卵巢置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2 ELISA法測(cè)定 兩組大鼠血樣靜置、離心、取血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)P、E2、LH水平。樣本孔按樣品∶樣品稀釋液=1∶4加入待測(cè)樣品，經(jīng)溫育洗滌后加入酶標(biāo)試劑50 μL和顯色劑A、B各50 μL，加入終止液15 min后測(cè)量吸光度(OD值，450 nm波長(zhǎng))，計(jì)算并分析血清樣本各激素水平。

1.2.3 H-E染色 將實(shí)驗(yàn)大鼠的卵巢組織常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5 μm，脫蠟至水后，分別用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色，經(jīng)脫水透明，用中性樹(shù)膠封片，鏡下觀(guān)察。

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 將卵巢組織常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4 μm，脫蠟至水后，用kisspeptin(1∶200)、kiss1r(1∶150)行免疫組織化學(xué)SP法染色(以上試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0對(duì)血清所測(cè)的P、E2和LH及黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r的免疫陽(yáng)性細(xì)胞OD值行t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠流產(chǎn)率的比較 大鼠流產(chǎn)率作為判定流產(chǎn)大鼠模型構(gòu)建成功的重要指標(biāo)。流產(chǎn)率=流產(chǎn)鼠胚胎只數(shù)/妊娠鼠胚胎只數(shù)×100%。如表1所示，與正常妊娠組流產(chǎn)率相比，流產(chǎn)組流產(chǎn)率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 兩組大鼠流產(chǎn)率的比較

2.2 血清中P、E2和LH的水平 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常妊娠組相比，流產(chǎn)組血清中P、E2水平明顯降低，而LH水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.3 卵巢黃體的形態(tài)學(xué)改變 H-E染色結(jié)果顯示，與正常妊娠組相比，流產(chǎn)組大鼠卵巢的黃體體積明顯減小，黃體中血管的數(shù)量明顯減少，但顆粒黃體細(xì)胞和膜黃體細(xì)胞的大小、形態(tài)和數(shù)量無(wú)明顯改變，主要表現(xiàn)為顆粒黃體細(xì)胞位于黃體的中央，數(shù)量多，胞體大，染色淺，而膜黃體細(xì)胞位于黃體周邊，數(shù)量少，胞體小，染色深(圖2)。

2.4 卵巢黃體中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在卵巢黃體的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈顆粒狀。與正常妊娠組相比，流產(chǎn)組大鼠黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3，表2)。

圖3 大鼠卵巢黃體中kisspeptin/kiss1r的表達(dá)(×400)

注：**P<0.01，*P<0.05。

3 討論

2003年的研究結(jié)果顯示kisspeptin受體kiss1r基因缺失或失活性突變能夠?qū)е碌痛傩韵偌に匦怨δ軠p退癥(iHH)[2-3]，kisspeptin對(duì)生殖功能的調(diào)節(jié)作用首次受到眾多學(xué)者的關(guān)注和重視。kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)不僅在下丘腦水平發(fā)揮作用，而且卵巢表達(dá)的kisspeptin可以直接調(diào)控卵巢的功能。有研究顯示，在嚙齒類(lèi)、猴子、人類(lèi)卵巢中均有kisspeptin和kiss1r的表達(dá)，尤其在成熟黃體的膜黃體和顆粒黃體細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)[4]。Horikoshi Y等[5]的研究結(jié)果顯示kisspeptin表達(dá)于絨毛的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，與非妊娠期相比，血漿中kisspeptin的水平隨著妊娠進(jìn)展迅速上升，至妊娠的第三個(gè)月約升高7 000倍左右，類(lèi)似于妊娠的標(biāo)志性激素絨毛膜促性腺激素(hCG)。這提示kisspeptin是否具有hCG作用，使卵巢黃體轉(zhuǎn)變?yōu)槿焉稂S體，支持和促進(jìn)卵巢黃體的發(fā)育，促進(jìn)黃體細(xì)胞分泌P。但黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在流產(chǎn)模型中黃體的發(fā)育和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用目前研究甚少。

我們以腹腔注射溴隱亭構(gòu)建的流產(chǎn)大鼠模型為研究對(duì)象，其中溴隱亭是一種多巴胺受體激動(dòng)劑，能夠與多巴胺結(jié)合抑制催乳素(PRL)的分泌。已有研究顯示，正常大鼠交配后，血漿中PRL水平顯著上升，除增加妊娠黃體PRL受體的表達(dá)外，PRL通過(guò)不同途徑促進(jìn)黃體功能，包括促進(jìn)雌激素受體(ER)α和β的合成以及上調(diào)LH受體，進(jìn)一步維持P的分泌，使P水平增加[6-7]。在黃體中P作為早期妊娠啟動(dòng)和維持最主要的激素，在臨床上P測(cè)定是了解卵巢功能和胎盤(pán)功能的重要途徑[8]，P水平降低，可能是排卵障礙、卵巢功能減退癥、黃體功能不全的表現(xiàn)，也可能是流產(chǎn)的先兆。當(dāng)P水平降低到一定程度時(shí)會(huì)對(duì)胎兒造成不可逆的損害，如懷孕后單次P<16 nmol/L(5ng/mL)，表示胎兒已經(jīng)死亡[9]。我們的HE染色結(jié)果顯示，與正常妊娠組相比，流產(chǎn)組卵巢中黃體的體積明顯減小，分泌E2、P的功能明顯減弱。有文獻(xiàn)報(bào)道，在大鼠的黃體細(xì)胞中，kisspeptin可直接增加P的分泌[10]。基于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推斷在流產(chǎn)模型中，黃體表達(dá)的kisspeptin可能通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢黃體的發(fā)育，從而影響其內(nèi)分泌功能。

另外，我們還推斷在流產(chǎn)模型中黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)可能通過(guò)下調(diào)血清中P水平引起流產(chǎn)的發(fā)生。有研究顯示在黃體細(xì)胞中不表達(dá)ERα，但高表達(dá)ERβ，雌激素通過(guò)ERβ發(fā)揮作用，P使其下調(diào)[11]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清中E2水平明顯下降，而P水平明顯下降，這提示在流產(chǎn)大鼠模型中，機(jī)體通過(guò)上調(diào)ERβ的水平暫時(shí)維持機(jī)體E2的作用。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道即使是退化的黃體也會(huì)發(fā)揮一定的作用。另外，與正常妊娠組相比，流產(chǎn)模型中LH水平明顯升高，有研究顯示在黃體中期，LH脈沖能夠促進(jìn)孕激素的分泌，給予促性腺激素釋放激素(GnRH)拮抗劑治療，能夠抑制外周P的水平[12]，這說(shuō)明LH在黃體細(xì)胞維持類(lèi)固醇功能方面發(fā)揮作用。另外，卵巢表達(dá)的P和E2對(duì)垂體發(fā)揮反饋調(diào)節(jié)作用，這可以解釋在流產(chǎn)后血清中LH水平升高的機(jī)制和原因。因此，在流產(chǎn)模型中卵巢黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)血清中E2、P和LH等激素水平，發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)檫M(jìn)一步研究流產(chǎn)的機(jī)制及治療方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有研究顯示kisspeptin明顯增加Erk1/2的磷酸化，而Erk1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059可以明顯抑制kisspeptin促進(jìn)黃體細(xì)胞分泌P的作用[13]，但在流產(chǎn)模型中黃體表達(dá)的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)是否通過(guò)Erk1/2信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)，我們還需進(jìn)一步研究和證實(shí)。

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The function of kisspeptin/kiss1r system expressed in the corpus luteum during the pathogenesis of spontaneous abortion rats

KOU Liancui1,2LUO Qianqian3SHI Yan1LI Hongxing1ZHANG Hongqin1

1 Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China；2 Department of Cardiothoracic Surgery,Dongying People 's Hospital；3 Morphology Laboratory,Experimental Teaching Management Center,Binzhou Medical University

Objective To observe the changes of kisspeptin/kiss1r system expression in corpus luteum and to explore the role of kisspeptin/kiss1r system on the pathogenesis of spontaneous abortion.Methods The spontaneous abortion rat model was constructed with bromocriptine and serum progesterone,estrogen,luteinizing hormone levels were detected by ELISA.Morphological changes of ovarian corpus luteum and the expression of kisspeptin/kiss1r were observed by H-E staining and immuno histochemistry,respectively.Results Compared with the pregnancy group,the rate of abortion was significantly increased and serum progesterone level as well as estrogen was significantly reduced in the abortion rats.Volume of corpus luteum was significantly reduced observed by H-E staining and the number of capillaries and kisspeptin/kiss1r positive cells in the ovary was significantly reduced during the abortion group.Conclusion The kisspeptin/kiss1r system expressed in the corpus luteum of abortion model play its regulatory role on incretion by altering the body's hormone levels. It will be used as an experimental basis for discussing the pathogenesis and treatment of abortion in the future.

kisspeptins,corpus luteum,spontaneous abortion

張洪芹，E-mail:byzhhq@163.com

R711.75

A

1001-9510(2016)06-0401-04

2016-09-09)