顱內(nèi)注射無水乙醇致小鼠腦損傷模型的初步觀察

胡 凡, 戴有金, 侯道榮

(南京醫(yī)科大學(xué), 南京 210000)

顱內(nèi)注射無水乙醇致小鼠腦損傷模型的初步觀察

胡 凡, 戴有金, 侯道榮

(南京醫(yī)科大學(xué), 南京 210000)

目的 經(jīng)顱注射無水乙醇建立小鼠腦損傷模型。方法 60只 ICR小鼠分為6組，顱內(nèi)注射不同劑量的無水乙醇，建立小鼠腦損傷模型。7 d后對各組小鼠腦組織做病理、丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)和基因表達等檢測。結(jié)果 15 μL無水乙醇劑量組的死亡率為30%，造模成功率為100%; 造模后各實驗組初期表現(xiàn)為行走和平衡功能障礙，后期恢復(fù)正常，但采食量和體質(zhì)量明顯下降。腦損傷造模后，神經(jīng)細胞出現(xiàn)壞死，周圍出現(xiàn)水腫并伴有神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞間隙擴大; 微血管外間隙擴大并且血管內(nèi)有血細胞滲出; 神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的出現(xiàn)空泡樣病變。腦組織SOD活性下降和MDA含量顯著升高。Q-PCR檢測環(huán)氧合酶-2(Cox-2),血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和突觸小體相關(guān)蛋白-25(SNAP-25) mRNA表達水平結(jié)果表明，與對照組相比，各實驗組COX-2, VEGF和SNAP-25 mRNA的表達顯著升高。結(jié)論 顱內(nèi)注射無水乙醇建立小鼠腦損傷模型較傳統(tǒng)大鼠腦損傷模型的建立操作簡單、模型表型均一，重復(fù)性好，成功率高。

腦損傷; 模型; 小鼠

在我國，腦損傷的發(fā)病率、致殘率和病死率較高，嚴重威脅著人類的健康和生命安全，因此，腦損傷的研究已成為當今醫(yī)學(xué)的研究熱點之一。理想的腦損傷動物模型是進行腦外傷研究的基礎(chǔ)，1970年代初，顱腦損傷的實驗研究才開始起步。1981年，F(xiàn)eeney 等[1]參照動物脊髓損傷模型，設(shè)計了自由落體腦損傷裝置，用于大鼠腦損傷實驗研究。目前已設(shè)計了不同類型的腦損傷模型，如凍傷性腦損傷模型、液壓傷腦損傷模型和自由落體腦損傷模型等[2-4]。各種腦損傷動物模型各有利弊，應(yīng)用的側(cè)重點也有差異。但在基礎(chǔ)研究中尚缺乏一種完全符合再現(xiàn)性好、重復(fù)性強、可定量分級、適應(yīng)性廣和操作簡單等要求的腦損傷動物模型。本研究采用顱內(nèi)注射無水乙醇方法建立小鼠腦損傷模型, 以期為相關(guān)的腦損傷研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性成年ICR小鼠60只, 體質(zhì)量25～30 g,購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK (蘇)2016-0002]。所有小鼠于南京醫(yī)科大學(xué)動物中心清潔級設(shè)施飼養(yǎng), 自由飲水、采食[SYXK (蘇)2013-0015]。

1.2 主要儀器及試劑

2 ,3 ,5 -三苯基氯化四氮唑(TTC), T8877，美國Sigma公司; TRIzol試劑B5704-1，RT-PCR試劑盒，RR037A，日本Takara公司; 引物, 南京銳真生物公司; Q-PCR試劑盒，LC96, 瑞士Roche公司; Q-PCR儀，美國Applied Biosystems公司; 全自動組織脫水機、包埋機，日本櫻花公司; 丙二醛(MDA，貨號: A003-1)和超氧化物歧化酶(SOD, 貨號: A001-1)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 動物模型建立

小鼠分為6組，每組10只。實驗組分為5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL乙醇組, 對照組即假手術(shù)組，顱內(nèi)注射質(zhì)量分數(shù)0.9% 氯化鈉5 μL。實驗組小鼠稱重后腹腔注射(0.2 mL/10 g)體積分數(shù)2%的水合氯醛麻醉。以bregma點為原點，后側(cè)0.1 mm, 左側(cè)1.0 mm, 使用牙科鉆在顱骨鉆孔后, 微量注射器緩慢注射相應(yīng)體積無水乙醇, 深度3.0 mm,注射完畢停留數(shù)分鐘，緩慢拔針，防止腦脊液滲出。注射完成后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。每天稱重并觀察活動、采食和精神狀態(tài), 7 d后處死取腦組織檢測。

1.4 行為學(xué)檢查

隨機選取造模前和造模后24 h各組小鼠(每組5只)進行神經(jīng)損傷嚴重程度評分(NSS)[5]，判斷各組小鼠的腦損傷程度。

1.4 小鼠腦TTC染色

小鼠脫頸椎處死, 斷頭快速取腦, 腦組織 -20 ℃冰凍5 min后, 由前極向后冠狀每隔2 mm切片。切片置于含2%TTC的0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)中，37 ℃ 避光孵育30 min后，在體積分數(shù)10%的中性甲醛溶液中固定后拍照。

1.5 小鼠腦組織病理觀察

6 d后將小鼠處死，取出腦組織，10%甲醛溶液容器中固定，延長軸切開并脫水包埋。對蠟塊進行切片(4 μm)，用HE染色后置于載玻片進行固定，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.6 腦組織MDA和SOD測定

每組小鼠處死后，迅速打開顱腔取出腦組織，準確稱取重量。在冰盤上用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，放在小燒杯中按重量(g): 體積(mL)=1∶9的比例加入冷生理鹽水，然后在冰上用眼科小剪刀盡快剪碎組織，放入勻漿管，補足冷生理鹽水制成組織勻漿。組織勻漿用4 ℃離心10 min (3 000 r/min)，取上清液進行SOD活性、MDA含量測定，具體操作方法均按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.7 腦組織環(huán)氧合酶-2(COX-2), 血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和突觸小體相關(guān)蛋白-25(SNAP-25) mRNA的表達

在1.5 mL無RNA酶離心管中將腦組織樣品剪碎后，使用超聲研磨機制成組織勻漿。使用TRIzol裂解細胞并抽提組織RNA。 參照RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于目的基因PCR擴增。程序設(shè)定為預(yù)變性95 ℃，10 min; 變性95 ℃，15 s;退火52～56 ℃，30 s; 延伸72 ℃, 30 s; 40個循環(huán)。各基因引物序列見表1。采用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

無水乙醇顱內(nèi)注射后實驗組小鼠較假手術(shù)對照組小鼠行動明顯減少, 被毛凌亂, 無光澤。早期運動時頭和身體向右側(cè)偏斜, 1 h后恢復(fù)正常。15 μL、20 μL和25 μL組在1～2 d內(nèi)出現(xiàn)死亡，15 μL和20 μL實驗組的死亡率分別為30%和70%, 25 μL組死亡率為100%。對照組、5 μL和10 μL實驗組未出現(xiàn)死亡各實驗組術(shù)后1周體質(zhì)量和采食量明顯下降。

表1 Q-PCR引物列表

2.2 小鼠腦損傷后NSS評分

對照組小鼠NSS分值在造模前后無明顯變化，而乙醇注射的各組小鼠造模后24 h NSS分值明顯增高(P＜0.01)(表2)。

表2 各組小鼠腦損傷前后 NSS分值比較

2.3 腦組織TTC染色

TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)產(chǎn)生變化而呈蒼白色。TTC染色結(jié)果顯示無水乙醇注射后腦組織出現(xiàn)壞死灶，呈蒼白色; 梗死腦組織邊界清晰(圖1A, C)，對照組未見異常(圖1B)。

2.4 腦組織病理學(xué)檢查

實驗組注射部位主要病理改變?yōu)樯窠?jīng)細胞周圍出現(xiàn)水腫，神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞間隙擴大；微血管外間隙擴大并且血管內(nèi)有血細胞滲出；神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的出現(xiàn)空泡樣病變(圖1F～G)。對照組腦組織微血管形態(tài)正常，神經(jīng)元排列整齊(圖1D)。

2.5 腦組織MDA和SOD水平檢測

與對照組相比，無水乙醇顱內(nèi)注射7 d后顯著性降低腦組織中SOD的活力(P＜0.01); 腦組織中MDA的含量水平顯著升高(P＜0.01)(表3)。

圖1 各組小鼠腦組織TTC和HE染色

表3 各組小鼠腦組織勻漿中MDA和SOD水平

2.5 腦組織COX-2, VEGF和SNAP-25 mRNA表達

與對照組比較，特別是乙醇注射量大于5 μL時，COX-2, VEGF和SNAP-25 mRNA表達差異顯著(P＜0.05)(表4)。

表4 造模后各組小鼠腦組織COX-2, VEGF和SNAP-25 mRNA表達變化(-ΔΔ Ct)

3 討論

乙醇是一種親神經(jīng)毒性物質(zhì)，具有脂溶性，極易透過血腦屏障，與腦中豐富的卵磷脂結(jié)合，使神經(jīng)細胞變性、神經(jīng)纖維脫髓鞘、大腦皮質(zhì)神經(jīng)元活動受到抑制, 產(chǎn)生持久的神經(jīng)毒性作用, 對中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)均可造成損傷[6]。大腦有很高的氧代謝率，其對于由乙醇引起的氧化應(yīng)激損傷尤為敏感。因此乙醇對肝、腦的損傷最為嚴重[7,8]。

本研究使用顱內(nèi)注射無水乙醇的方法制作小鼠腦組織損傷動物模型。動物顱內(nèi)注射不同劑量的乙醇后出現(xiàn)不同程度的死亡。存活的動物采食量和體質(zhì)量顯著下降。乙醇注射后早期出現(xiàn)歪脖，身體向右側(cè)傾斜運動等行為癥狀，這一癥狀和大鼠顱內(nèi)乙醇注射癥狀相似[9]。造模前后NSS評分也表明造模后小鼠出現(xiàn)了明顯的腦組織損傷。小鼠的腦損傷主要病理改變?yōu)樯窠?jīng)細胞周圍出現(xiàn)水腫和壞死，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞間隙擴大; 微血管通透性增加并且血管內(nèi)有血細胞滲出形成微血栓; 神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的出現(xiàn)空泡樣病變; 同時還引起腦組織超SOD下降和MDA顯著升高。SOD和MDA的水平或活性的高低與氧自由基導(dǎo)致的腦損傷相關(guān)。以上結(jié)果和放射、冷凍以及缺血所致動物腦損傷的結(jié)果相似[10-13]。

本研究中腦內(nèi)乙醇注射引起SNAP-25, VEGF，COX-2的表達升高。SNAP-25是主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì), 對毒物敏感且對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起重要作用[14]; SNAP-25 mRNA 表達增加說明Snap-25蛋白合成增多，SNAP-25 蛋白參與了神經(jīng)遞質(zhì)的組裝、轉(zhuǎn)運和?？康冗^程, 對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起到重要作用, 它的合成增多提示有更多的神經(jīng)遞質(zhì)被釋放。以此緩解乙醇所導(dǎo)致的小鼠驚厥抽搐等癥狀。本研究中乙醇注射初期小鼠出現(xiàn)頭和身體傾斜和抽搐，此后恢復(fù)正?；蛟S與此有一定關(guān)系。VEGF和COX-2在正常成熟腦組織中鮮有表達, 在缺氧、缺血、外傷、腫瘤、脫髓鞘病變等病理狀態(tài)下, 腦組織中VEGF蛋白表達顯著升高[15-18]。乙醇所致的腦損傷誘導(dǎo)了VEGF和COX-2的表達。VEGF具有促血管新生及致血管高滲兩項生物學(xué)特性[19]。COX-2是一種可誘導(dǎo)酶[20]，上調(diào)的COX-2進一步介導(dǎo)前列腺素E2(PGE2)的生成，促進局部血管擴張，引起毛細血管通透性增加，誘發(fā)紅、腫、熱、痛及缺氧等功能障礙的作用[21, 22]。缺氧又可以使腦組織能量代謝發(fā)生障礙，抑制細胞膜上的鈉/鉀ATP酶活性，影響細胞膜內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運，形成細胞內(nèi)高滲狀態(tài), 大量水分內(nèi)流入胞內(nèi), 引發(fā)細胞水腫[23]。

成功的腦外傷實驗有賴于既能反映腦損傷的特點，又便于進行觀察和施加處理因素的腦外傷動物模型的建立。理想的腦外傷動物模型制作方法應(yīng)具有: 再現(xiàn)性好、重復(fù)性強、可定量分級、適應(yīng)性廣和操作簡單等特點。一個理想的動物模型應(yīng)有一定的發(fā)病率和一定的死亡率[24]。研究表明顱內(nèi)注射20 μL和25 μL無水乙醇導(dǎo)致死亡率較高, 15 μL注射劑量的死亡率是30%，是最好的劑量選擇。該腦損傷模型制作方法具有以下優(yōu)點: (1)損傷機制明確, 便于定性研究; (2)模型制作耗時少，方法簡單，條件易于控制; (3)致?lián)p傷程度較為一致，定量準確，重復(fù)性好; (4)模型腦損傷定位準確，建模后便于后續(xù)實驗定位，如干細胞損傷部位注射等；(5)所制備的動物模型的腦損傷以血管源性腦水腫為主, 同時伴有局部腦組織的壞死性損傷，性質(zhì)與臨床上創(chuàng)傷性腦水腫相似; (6)實驗對象為小鼠, 價廉，便于大批量研究。本研究建立的顱內(nèi)注射乙醇致腦損傷小鼠模型將為腦損傷的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

[1] Feeney DM, Boyeson MG, Linn RT, et al. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat[J]. Brain Res, 1981, 211(1):66-67.

[2] 袁紹紀, 朱誠, 陳柏林, 等. 大鼠急性創(chuàng)傷性腦水腫模型的建立[J]. 上海醫(yī)學(xué), 1989, 2(5):276-279.

[3] Chan PH, Fishman RA. Phospholipid degenadation and the early release of polyunsaturated Fatty acids in the evoluation of brain edema. In: Recent progress in the study and therapy of brain edema[M]. Go DG, Baethmann A, eds, New York: Plenem Press, 1984:193-202.

[4] McIntosh TK. Traumatic brain injury in the rat: Characterization of a lateral fluid-percussion model[J]. Neuroscience, 1989, 28(1):233-241.

[5] Shapira Y, Lam AM, Eng CC, et al. Therapeutic time window and dose response of the beneficial effects of ketamine in experimental head injury[J]. Stroke, 1994, 25(2):1637-1643.

[6] 李翠蓮, 石秋艷. 慢性酒精中毒腦損害[J]. 實用心腦肺血管病雜志, 2010, 18(2):197-198.

[7] Fakoya FA, Caxton-Martins EA. Neocortical neurodegeneration in young adult Wistar rats prenatally exposed to ethanol[J]. Neurotoxicol Teratol, 2006, 28(2):229-237.

[8] 曾濤, 張翠麗, 宋福永, 等. 一次性大劑量乙醇攝入對小鼠肝臟損傷作用的研究[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2009, 26(7): 579-582.

[9] 賀繼剛, 沈振亞, 滕小梅, 等. 經(jīng)顱注射無水乙醇建立大鼠腦損傷模型初步探討[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學(xué), 2013, 33(2):117-120.

[10] 陳世文, 周曉平, 田恒力. 大鼠冷凍性腦損傷模型的建立[J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2007, 9(3):237-240.

[11] 白紅民, 費舟, 章翔, 等. 大鼠二次腦損傷模型的建立[J]. 中華創(chuàng)傷雜志, 2002, 18(4):214-217.

[12] 馬辰鶯, 徐曉婷, 涂彧, 等. VEGF mRNA及蛋白在大鼠放射性腦損傷模型中的動態(tài)變化[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志, 2014, 34(6):405-410.

[13] 熊耀祖, 孫陽, 涂彧, 等. 大鼠放射性腦損傷模型中Cox-2 mRNA及蛋白的動態(tài)變化研究[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志, 2016, 36(1):24-27.

[14] 黃培軍, 徐培渝. Snap-25 mRNA 在毒鼠強中毒大鼠腦組織的表達[J]. 四川大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2004, 35(5):644-646.

[15] Karamysheva AF. Mechanisms of angiogenesis[J]. Biochemistry (Mosc), 2008, 73(7):751-762.

[16] Khan Z, Khan N, Tiwari RP, et al. Biology of Cox-2: all application in cancer therapeutics[J]. Curt Drug Target, 2011, 12(7):1082-1093.

[17] Sellers RS, Radi ZA, Khan NK. Pathophysiology of cyclooxygenases in cardiovascular homeostasis[J]. Vet Pathol, 2012, 47(6):601-613.

[18] Murono S, Inoue H, Tanabe T, et al. Induction of cyclooxygenase-2 by epstein-barr virus latent membrane protine 1 is involved in vascular endothelial growth factor production in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(12):6905-6910.

[19] Greene-Schloesser D, Robbins ME, Peiffer AM, et al. Radiation-induced brain injury: a review[J]. Front Oncol, 2012, 2 (73):1-18.

[20] Kalinski P. Regulation of immune responses by prostaglandin E2[J]. J Immunol, 2012, 188(1):21-28.

[21] Ji K, Tsirka SE. Inflammation modulates expression of laminin in the central nervous system following if chemic injury[J]. Neuroinflamm, 2012, 9(159):1-12.

[22] Lucas J, Mack WJ. Effects of ionizing radiation on cerebral vasculature: a review[J]. World Neurosurg, 2014, 81(3-4): 490-491.

[23] Toomey DP, Murphy JF, Conlon KC, et al. Cox-2, VEGF and tumour angiogenesis[J]. Surgeon, 2009, 7(3):174-180.

[24] 溫妙云, 鄭俠, 鄧醫(yī)宇, 等. 內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠建立膿毒癥腦損傷模型[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(3):198-200.

Establishment of Brain Injury Model in Mouse by Intracranial Injection of Anhydrous Ethanol

HU Fan, DAI You-Jin, HOU Dao-Rong
(Nanjing Medical University, Nanjing 210000, China)

ObjectiveTo establish a stable mouse model of brain injury by ethanol intracranial injection.MethodsSixty ICR mice were randomly divided into 6 groups: sham group (n=10), 5 μL group (n=10), 10 μL group (n=10), 15 μL group (n=10), 20 μL group (n=10) and 25 μL group (n=10). The mice were intranscranially injected with different doses of ethanol. After 7 days, pathological examination was performed and the level of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and relevant genes expression were detected.ResultsAfter model made, the ethanol injection mice showed walk and balance function obstacle at early time, and returned to normal later, but feed intake and body weight significantly decreased. With HE staining, the nerve cell necrosis and surrounding tissue edema, neurons and glial cells intercellular space expansion, microvascular clearance outside enlarge and vascular diapedesis, the nerve cells and glial cells cavity lesions were detected. The activity of SOD were decreased and content of MDA were increased. The cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) and synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) mRNA expression was significantly increased in experimental group compared with control group, detected by Q-PCR.ConclusionThe mouse model of brain injury made by intracranial injection with ethanol have the advantages of simple, phenotypic uniformity, good repeatability, high success rate compared to traditional brain injury model making.

Brain injury; Model; Mouse; Ethanol

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0428-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.005