不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響

王 偉，徐雙雙，郜愛玲，權 偉，盧 珊*，金荷仙

（1溫州科技職業(yè)學院，溫州 325006；2浙江農(nóng)林大學，臨安 311300）

不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響

王 偉1，徐雙雙1，郜愛玲1，權 偉1，盧 珊1*，金荷仙2

（1溫州科技職業(yè)學院，溫州 325006；2浙江農(nóng)林大學，臨安 311300）

選擇6-BA、NAA、培養(yǎng)基種類和有機添加物種類等4個因素進行L16（44）正交試驗，研究各因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響。結果表明：將無菌播種50 d已突破種皮的原球莖轉(zhuǎn)接于含3 g/L花寶1號+2 g/L蛋白胨+0.2 mg/L NAA+10%馬鈴薯提取液+20 g/L蔗糖（pH 5.6）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)70 d，分化效果最好。6-BA對原球莖分化影響最為顯著。

大苞鞘石斛；組織培養(yǎng)；原球莖分化；正交試驗

大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum）主產(chǎn)于云南騰沖地區(qū)，為附生蘭，對生境要求苛刻，生長緩慢，種子極小且無胚乳，自然繁殖率低，因觀賞價值高、可藥用［1］，被盜挖者過度采集，野生資源數(shù)量明顯下降。針對該現(xiàn)狀，對大苞鞘石斛種質(zhì)資源的保護和研究逐漸引起了各界學者的重視，LUAN等［2］發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L、20%CW、蔗糖30 mg/L可作為大苞鞘石斛無菌播種培養(yǎng)基；SHARMA等［3］認為，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2.5 mg/L硝酸鈣可使外植體直接形成叢生芽，添加低濃度的尿素有利于擬原球莖分化為完整植株，繼而他成功將大苞鞘石斛擬原球莖制作為人工種子且可全部萌發(fā)于MS培養(yǎng)基上［4］；卓孝康等［5］利用正交試驗，初步探索了激素和添加物對大苞鞘石斛植株再生的影響；吳元玲等［6］、劉曉東等［7］對大苞鞘石斛原球莖超低溫保存技術及其保存中生理生化的變化進行了研究與探討，為實現(xiàn)長期穩(wěn)定保存大苞鞘石斛種質(zhì)資源奠定了基礎。

筆者在長期試驗中發(fā)現(xiàn)，大苞鞘石斛無菌播種育苗周期長于其他石斛種類，培養(yǎng)過程中需要經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接才可順利成苗，而原球莖分化階段的繼代培養(yǎng)與后期育苗質(zhì)量及周期長短關系密切。目前，關于不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化影響方面的研究甚少。為此，本試驗利用6-BA、NAA、培養(yǎng)基種類、有機添加物種類等4個因素設計L16（44）正交試驗，研究不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響，以期篩選出適宜的培養(yǎng)基配方，為大苞鞘石斛種質(zhì)資源的保育和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗所用原植物采自我國云南騰沖地區(qū)，經(jīng)上海辰山植物園黃衛(wèi)昌高級工程師鑒定為蘭科石斛屬大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum）的新鮮植株，所用原球莖是經(jīng)過人工授粉的蒴果無菌播種于無激素B5培養(yǎng)基（椰乳20%，綿白糖20 g/L）50 d所得，挑選處于同一生長期（原球莖已突破種皮并出現(xiàn)芽點）、色澤鮮綠、直徑（0.65±0.05）mm，且沒有分化的原球莖作為分化試驗材料。

1．2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)接方法

材料選取萌發(fā)試驗中培養(yǎng)50 d后得到的原球莖，利用接種勺在超凈工作臺上將其取出，并挑選出符合試驗條件的原球莖轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基設計與培養(yǎng)條件

對6-BA、NAA、培養(yǎng)基、有機添加物等4個因素選取4個水平研究其對原球莖分化的影響（表1）。設計L16（44）正交試驗，共16個處理，待檢培養(yǎng)基pH 5.6，附加20 g/L蔗糖、7.6 g/L瓊脂。培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強度約2 000 lx，光照時間16 h/d。16個待檢培養(yǎng)基處理分別接種8瓶，重復3次。

表1 大苞鞘石斛原球莖分化培養(yǎng)基配方正交試驗設計L16（44）Table 1 Orthogonal design scheme L16（44）of the culture media for protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

1.2.3 觀察記錄

培養(yǎng)過程中，每10 d在超凈工作臺上觀查1次原球莖分化情況，并記錄原球莖直徑（mm）、葉片分化數(shù)量、根數(shù)等；培養(yǎng)70 d后，將幼苗從瓶內(nèi)取出，測量株高（mm）、根長（mm）、葉片長度（mm），統(tǒng)計根分化量（%）、葉分化量（%）和平均生根數(shù)等6項指標。

平均生根數(shù)＝生根根數(shù)/生根株數(shù)

根分化量＝生根株數(shù)/總株數(shù)

葉分化量＝已分化葉的株數(shù)/總株數(shù)

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對各觀測指標進行相關性分析、方差分析和極差分析。

2 結果與分析

2．1 大苞鞘石斛原球莖分化結果

大苞鞘石斛原球莖（圖1a）分化需要較長的時間，接種10 d后，原球莖開始膨大且頂部葉原基隆起，并伴有白色絲狀物產(chǎn)生；20—40 d，原球莖直徑增至2 mm左右，縱軸生長加快（圖1b），40 d時，原球莖已初步分化為幼苗形態(tài)，葉片數(shù)量1—2片，根≤1條；40—60 d，幼苗多具兩葉，部分開始分化第三葉，根系數(shù)量1—3條；60 d后分化出第三葉的小苗節(jié)間伸長開始進行高生長，且部分幼苗基部產(chǎn)生擬原球莖或叢生苗；培養(yǎng)70 d，原球莖已完全分化為幼苗（圖1c）。培養(yǎng)結果（表2）顯示，各項觀測指標值在不同因素、不同水平培養(yǎng)條件下存在一定差異。

2．2 相關性分析

為了進一步研究6項觀測指標之間是否存在相關性，從而有效判斷在16個試驗組合中原球莖分化效果最優(yōu)的組合，對正交試驗結果進行了相關性分析，結果顯示（表3），原球莖分化為苗后的株高、根分化量、平均根數(shù)、根長、葉長和葉分化量之間除根分化量與葉長之間無顯著性相關關系外，其他各觀測指標之間均呈顯著正相關，說明各觀測指標之間有較強的聯(lián)系。

圖1 大苞鞘石斛原球莖分化過程Fig．1 Protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

表2 原球莖分化正交試驗結果（n＝3）Table 2 Results of orthogonal test of protocorm differentiation（n＝3）

表3 大苞鞘石斛原球莖分化觀測指標的相關性分析（n＝3）Table 3 Correlation analysis of observation index of protocorm differentiation of Dendrobium wardianum（n＝3）

結合以上分析，可將6項觀測指標分組進行綜合分析：將觀測指標株高作為原球莖分化的莖生長狀況，反映4個因素對莖生長的促進作用；將根分化量、平均根數(shù)和根長3個觀測指標綜合考慮，反映4個因素對根系發(fā)育的影響；將葉長和葉分化量兩個觀測指標綜合考慮，反映4個因素對原球莖葉分化和生長的促進作用。

2．3 不同因素對原球莖分化的影響

2.3.1 不同因素對莖生長的影響

對培養(yǎng)70 d后的6項觀測指標進行方差分析，結果（表4）表明，6-BA對原球莖分化高度的影響達到顯著水平。如表5所示，比較各因素R值大小可知，4個因素對原球莖分化后株高影響大小排序為6-BA＞NAA＞培養(yǎng)基＞有機添加物。根據(jù)各因素水平均值（ki）的大小，可初步推斷影響原球莖分化莖生長的最優(yōu)水平組合為1-2-2-4，即0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA、3 g/L花寶1號+2 g/L蛋白胨和馬鈴薯提取液。

表4 各培養(yǎng)基配方方差分析Table 4 Variance analysis of each medium formula

表5 不同因素對原球莖分化高度的影響Table 5 Effects of different factors on the height growth of protocorm differentiation of Dendrobium wardianummm

2.3.2 不同因素對根系發(fā)育的影響

不同因素對根系發(fā)育的影響具有一定的差異性。方差結果顯示（表4），6-BA對根長的影響達到顯著水平，而4個因素對平均根數(shù)和根分化量的影響未達到顯著水平。根據(jù)各因素R值大小可知（表6），4個因素對根系發(fā)育影響強弱表現(xiàn)為6-BA＞有機添加物＞培養(yǎng)基＞NAA。大苞鞘石斛原球莖根分化量及根長的最佳培養(yǎng)配方為1-2-2-4，而水平組合1-3-2-4為影響平均根數(shù)的最優(yōu)組合。

表6 不同因素對原球莖分化根系發(fā)育的影響Table 6 Effects of different factors on the root development of protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

2.3.3 不同因素對葉分化的影響

由方差分析結果可知（表4），6-BA對原球莖葉分化量的影響達到極顯著性水平，而4個因素對葉長指標的影響未達到顯著水平。通過比較R值可知（表7），各因素中對大苞鞘石斛葉長起主導作用的為培養(yǎng)基；4個因素影響原球莖葉分化量的主次程度為6-BA＞培養(yǎng)基＞有機添加物＞NAA。對葉長有促進作用的最佳水平組合為1-1-2-4，影響葉分化量的最佳配方為1-1-1-4。

表7 不同因素對原球莖分化葉分化的影響Table 7 Effects of different factors on the leaf differentiation of Dendrobium wardianum protocorm

3 討論與結論

不同因素對大苞鞘石斛原球莖分化的影響差異較大。大苞鞘石斛原球莖分化只需單獨添加低質(zhì)量濃度的NAA（≤0.5 mg/L），且當濃度變化時會對原球莖不同部位的分化有著促進作用。曾宋君等［8］研究也認為NAA質(zhì)量濃度為0.2—0.5 mg/L最適宜美花石斛、密花石斛等5種石斛胚萌發(fā)和成苗；卓孝康等［5］的研究也表明較高質(zhì)量濃度的生長素（NAA≥0.5 mg/L）不利于大苞鞘石斛原球莖葉芽分化。本試驗表明，添加馬鈴薯提取液對原球莖分化的葉長、根分化量和高等指標促進作用最為明顯。這與喇叭唇石斛原球莖分化（添加10%馬鈴薯汁）、霍山石斛擬原球莖分化（添加8%馬鈴薯提取液）等研究結果基本一致［9-10］。

本試驗發(fā)現(xiàn)，大苞鞘石斛原球莖在分化過程中，B5培養(yǎng)基和3 g/L花寶1號+2 g/L蛋白胨培養(yǎng)基在原球莖分化過程中會直接分化出不定芽，而B5+2 g/L蛋白胨培養(yǎng)基較易產(chǎn)生團狀擬原球莖，且剝離后可作為繼代擴繁的原始材料。陳娜等［11］通過電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，大苞鞘石斛無菌播種的原球莖分化過程中，有低比例的愈傷組織出現(xiàn)，愈傷組織可分化形成擬原球莖或直接分化成芽。利用該特性，可以更便捷地誘導和獲得擬原球莖，提高誘導成功率，節(jié)省組培成本和時間。

本研究表明：（1）6-BA對原球莖分化影響最為顯著，且為抑制作用。根據(jù)4個因素對觀測指標影響的主次程度可知，對莖、根、葉三部位分化與生長促進作用最強的因素分別為NAA、有機添加物和培養(yǎng)基。（2）從各因素不同水平組合對原球莖的莖、根、葉的優(yōu)選組合來看，NAA為0—0.5 mg/L時，對莖、根及葉的分化均有較優(yōu)的促進作用，且在0.2 mg/L時，對莖的高度、根長和根分化量的促進效果均優(yōu)于其他濃度水平；培養(yǎng)基為3 g/L花寶1號+2 g/L蛋白胨時，對莖、根以及葉長均有較優(yōu)的促進作用，B5培養(yǎng)基僅在對葉分化量方面促進作用較優(yōu)；有機添加物為10%的馬鈴薯提取液時，對莖、根、葉的促進作用最優(yōu)。綜合考慮各因素對原球莖分化的莖、根、葉的整體影響，最優(yōu)方案可確定為0.2 mg/L NAA+3 g/L花寶1號+2 g/L蛋白胨+10%馬鈴薯提取液+20 g/L蔗糖，pH 5.6。

［1］管艷紅，馬潔，張麗霞.西雙版納石斛屬藥用植物資源［J］.中國野生植物資源，2004，23（6）：38-39.

［2］LUAN V Q，THIEN N Q，KHIEM D，et al.In vitro germination capacity and Plant Recovery of Some Native and Rare Orchids［C］//Proceedings of International workshop on biotechnology in agriculture.Nong Lam University Ho Chi Minh City，Vietnam，2006：175-177.

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［5］卓孝康，蘭思仁，彭東輝，等.大苞鞘石斛胚組織培養(yǎng)及植株再生研究［J］.福建林學院學報，2014，34（4）：289-296.

［6］吳元玲，申曉輝.大苞鞘石斛原球莖玻璃化超低溫保存技術的研究［J］.中國細胞生物學學報，2011，33（3）：279-287.

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［11］陳娜，方炎明，程磊.大苞鞘石斛種子萌發(fā)過程中形態(tài)變化研究［J］.安微農(nóng)業(yè)科學，2013，41（3）：1038-1040.

（責任編輯：閆其濤）

Influence of different factors on the protocorm differentiation of Dendrobium wardianum

WANG Wei1，XU Shuang-shuang1，GAO Ai-ling1，QUAN Wei1，LU Shan1*，JIN He-xian2
（1Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006，China；2Zhejiang A＆F University，Lin’an 311300，China）

Four factors such as 6-BA，NAA，different culture medium and organic additives with 4 levels were selected to study the effects of different factors on the protocorm differentiation of Dendrobium wardianum by orthogonal test.The results showed that the protocorm obtained by sterile culture for 50 d inoculated in the differentiation medium of Hyponex No.1 3 g/L+peptone 2 g/L+NAA 0.2 mg/L+potato extract 10%+sugar 20 g/L（pH5.6）for 70 d could get the best differentiation effect.6-BA had the most significant effect on the differentiation of protocorm.

Dendrobium wardianum；Tissue culture；Protocorm differentiation；Orthogonal test

S567.2

A

1000-3924（2016）06-043-05

2015-11-16

浙江省教育廳高校國內(nèi)訪問工程師校企合作項目（FG2014199）

王偉（1981—），男，碩士，講師，主要從事園林植物栽培與育種工作

盧珊（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事植物栽培、教學管理研究等工作