金絲桃苷與DNA結(jié)合方式的研究*

喬春玉，張重越，孫艷濤，閆 鵬，肖 雪，朱傳勇

（1.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，黑龍江 哈爾濱 150040；3.吉林師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 四平136000）

金絲桃苷與DNA結(jié)合方式的研究*

喬春玉1，張重越2，孫艷濤3，閆 鵬1，肖 雪1，朱傳勇1

（1.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，黑龍江 哈爾濱 150040；3.吉林師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 四平136000）

研究了黃酮類化合物—金絲桃苷與DNA的相互作用，通過對紫外吸收光譜、熔點(diǎn)溫度和黏度的測定，確定了其結(jié)合機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)金絲桃苷與DNA結(jié)合后紫外吸收峰在一定程度上發(fā)生了變化。通過熔點(diǎn)曲線和黏度測試進(jìn)一步驗(yàn)證了金絲桃苷與DNA的結(jié)合機(jī)理，確定了二者的結(jié)合方式是嵌入式結(jié)合。

金絲桃苷；DNA；吸收光譜；熔點(diǎn)

前言

脫氧核糖核酸（DNA）是生物體中最基本的遺傳物質(zhì)，同時也是一種非常重要的生物大分子，DNA分子構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的變化在生物體系方面發(fā)揮著重要作用。小分子與DNA的作用的研究方法有很多，近年來的相關(guān)的報道越來越多[1～3]。DNA與生物的生長，發(fā)育以及癌變等異?；顒酉嚓P(guān)。絕大多數(shù)藥物分子在生物體內(nèi)的靶向目標(biāo)都是DNA，通過與DNA的相互作用來控制DNA參與的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，從而改變DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。因此，通過研究藥物小分子與DNA的相互作用可以了解藥物作用機(jī)理，從而進(jìn)行藥物體外篩選，利用藥物的構(gòu)效關(guān)系能夠進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，從而設(shè)計(jì)出活性更高、毒副作用更低的新藥。

目前普遍認(rèn)為：小分子與DNA的非共價鍵作用包括靜電結(jié)合、溝區(qū)結(jié)合和嵌入式結(jié)合三種作用方式，前兩者也可統(tǒng)稱為非嵌入結(jié)合方式[4]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

鮭魚精DNA；金絲桃苷（結(jié)構(gòu)式如圖1所示）；BR緩沖溶液；文中涉及到的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

圖1 金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structure of hyperoside

1.2 儀器

GBC Cintra 10e紫外－可見光譜儀；烏氏黏度計(jì)；pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)；電子恒溫水浴鍋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

分別對金絲桃苷溶液和DNA進(jìn)行紫外可見吸收光譜測定，再固定金絲桃苷的濃度，向其溶液中加入DNA后，在相同條件下，測定混合液的紫外可見吸收光譜。

分別測定DNA溶液以及DNA－金絲桃苷混合液的最大紫外吸收峰，在20～100℃時，每隔2～5℃記錄一次讀數(shù)，突躍中點(diǎn)的溫度即為DNA的熔點(diǎn)（Tm）。

在25℃下，使用烏氏黏度計(jì)測定藥物對DNA黏度的影響，即固定DNA溶液的濃度，改變金絲桃苷的濃度，分別測定緩沖溶液以及DNA與金絲桃苷混合溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時間，平行記錄三組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜研究

圖2是金絲桃苷（a）、DNA（b）以及DNA-金絲桃苷混合液（c）的紫外可見吸收光譜圖。

圖2 金絲桃苷（a）、DNA（b）和DNA-金絲桃苷（c）的吸收光譜圖Fig.2 The absorption spectra of hyperoside（a）,DNA（b）and DNA-hyperoside（c）

由圖2可以看出，加入DNA后，吸收峰在一定程度上發(fā)生了變化，但是變化并不是很明顯，由此可以說明藥物與DNA之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，但是二者以何種方式結(jié)合還不能說明。

2.2 DNA熔點(diǎn)的研究

為了判斷金絲桃苷與DNA的結(jié)合方式，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考查了金絲桃苷對DNA熔點(diǎn)的影響。本實(shí)驗(yàn)采用研究DNA熔點(diǎn)曲線的經(jīng)典方法——紫外法。DNA的熔點(diǎn)又稱為熔解溫度（melting temperature）通常用Tm表示，是DNA加熱變性，使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度。DNA變性時，物理化學(xué)性質(zhì)將隨之發(fā)生改變，表現(xiàn)為增色效應(yīng)（即ε增大的現(xiàn)象）。當(dāng)DNA達(dá)到Tm時，分子內(nèi)有50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被打開，也就是說增色效應(yīng)達(dá)到一半時的溫度。

實(shí)驗(yàn)中分別對DNA、DNA-金絲桃苷進(jìn)行了熔點(diǎn)測定，從20～100℃不斷記錄各溫度時體系的吸光度并繪制成曲線，如圖3所示。一般情況下，小分子與DNA相互作用能夠影響其熔點(diǎn)Tm，若是嵌入式作用則能使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，Tm會增加5～8℃，而非嵌入作用則不會使熔點(diǎn)溫度有明顯的增加[5]。由圖3可以看出，當(dāng)DNA溶液中加入金絲桃苷后，DNA的熔點(diǎn)明顯增加。由此我們可以推斷出，金絲桃苷與DNA是以嵌入式結(jié)合在一起的。

圖3 金絲桃苷加入前（a）后（b）DNA的熔點(diǎn)曲線Fig.3 The melting points curves of DNA in the absence of hyperoside（a）and in the presence of hyperoside（b）

2.3 黏度實(shí)驗(yàn)

黏度法即流體力學(xué)法是研究藥物小分子與DNA作用模式的另一種最有力的實(shí)驗(yàn)方法，因?yàn)樗鼘NA的長度變化比較敏感[6]。一般來說，如果藥物分子與DNA通過經(jīng)典嵌插方式作用時，DNA相鄰堿基對的距離會變大以容納插入配體，導(dǎo)致DNA雙螺旋鏈伸長，由此使DNA溶液的黏度增大[7]；當(dāng)藥物分子與DNA以靜電、溝槽結(jié)合等非嵌插方式與DNA作用時，DNA溶液的黏度無明顯變化；以部分插入方式與DNA作用時，則可能使DNA的雙螺旋鏈彎曲或褶皺，長度減小，因而其黏度下降[8]。

在室溫下測定了金絲桃苷對DNA黏度的影響。測試液的相對黏度按下式計(jì)算：

η＝（t-t0）/t0

其中t0為緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間，t為DNA溶液（含不同濃度的金絲桃苷）流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間，η0為未加金絲桃苷時DNA溶液的相對黏度。根據(jù)Cohen和Eisenberg理論[9]，以（η/η0）1/3對結(jié)合比率r（r=[金絲桃苷]/[DNA]）作圖，可以得到金絲桃苷對DNA溶液黏度的影響，如圖4所示。結(jié)果表明，隨著金絲桃苷濃度的增加，DNA溶液的黏度增大了。這種行為進(jìn)一步說明，這藥物與DNA的結(jié)合方式是嵌入式的。

A Study on the Interactions of Hyperoside with DNA

QIAO Chun-yu1,ZHANG Chong-yue2,SUN Yan-tao3,YAN Peng1,XIAO Xue1and ZHU Chuan-yong1
（1.College of Material and Chemical Engineering,Heilongjiang Institute of Technology,Harbin 150050,China;2.Department of Pathology,First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.College of Chemistry,Jilin Normal University,Siping 136000,China）

The interactions of flavonoids with DNA,such as hyperoside with fish sperm DNA were studied.The bonding mechanism was confirmed by the UV-absorption spectrum,melting temperature and viscosity measurement.The experimental results indicated that when bonded to DNA,the absorption peak of hyperoside had changed in a certain extent.The studies on the melting temperature（Tm）curves and viscosity measurements had also verified the bonding mechanism of hyperoside to DNA,and the bonding mode was confirmed to be intercalative bonding.

Hyperoside;DNA;absorption spectrum;melting temperature

R 968

A

1001-0017（2016）06-0439-03

2016-05-12 *基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：12541674）

喬春玉(1980-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，博士，講師，研究方向：分析化學(xué)。E-mail：jingjing_3939@sina.com.