周期療法對乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影響

錢小玲

（廣西醫(yī)科大學中西醫(yī)結合臨床系 廣西南寧 530021）

周期療法對乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK的影響

錢小玲

（廣西醫(yī)科大學中西醫(yī)結合臨床系 廣西南寧 530021）

目的探討周期療法經驗方對乳腺增生病模型大鼠ER、PR、ERK表達的影響。方法從90只大鼠隨機分為空白組、模型組、逍遙丸組、三苯氧胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，除空白組外其余各組均進行乳腺增生造模。待造模成功后，空白組和模型組給生理鹽水0.2ml/kg·d灌胃，其余5組分別給與逍遙丸、三苯氧胺、中藥（Ⅰ號方、Ⅱ號方）灌胃，共30天。結果造模后，各造模組大鼠的乳頭直徑與空白組比較有差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。灌服Ⅰ號方后各用藥組大鼠乳頭直徑縮小，但仍大于空白組（P＜0.05）。灌服Ⅱ號方后大鼠的乳頭直徑進一步縮小，各用藥組小于模型組（P＜0.05），除中藥高劑量組外余各組大于空白組（P＜0.05）；各組ER、PR、ERK積分與模型組相比較均較低（P＜0.05），中藥高劑量組ERK積分低于三苯氧胺組（P＜0.05）。結論中藥周期療法經驗方可使乳腺增生模型大鼠增生乳頭縮小，ER、PR、ERK積分降低。

乳腺增生?。恢芷诏煼?；ER；PR；ERK

我們在長期的醫(yī)療實踐中積累了豐富的治療乳腺增生病經驗，在臨床上尤其擅長用疏肝散結、補腎柔肝周期療法治療乳腺增生?。?-2］，為了探討治療乳腺增生病經驗方的作用機制，特進行了本次實驗。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取SPF級3～4月齡、健康雌性SD大鼠90只，體重200±20g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級實驗室提供，批號為 SXXK（陜）2015-0431-820010054。

1.2 主要試劑、藥品 苯甲酸雌二醇注射液（杭州動物藥品廠，批號：140429）、生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1206191101）、黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：130702）、三苯氧胺（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號：14042911）、逍遙丸（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：14A28）、中藥（I號方組成：柴胡、赤芍、枳實、川楝子、夏枯草、白蒺藜、全瓜蔞、鱉甲、王不留行、當歸、生地、海藻、昆布。II號方組成：柴胡、醋香附、元胡、王不留行、川楝子、夏枯草、當歸、杭白芍、海藻、昆布、何首烏、菟絲子、肉蓯蓉、巴戟天、知母、黃柏）。以上藥物均購自陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科。兔抗鼠ERK抗體（編號：ZS-940，批號：G0110）、兔抗鼠ER抗體（編號：ZS-5420，批號：23546）、兔抗鼠PR抗體（編號：ZS-5380，批號：23546）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 實驗方法

從90只大鼠中隨機抽取20只，為空白組，右下肢肌肉注射生理鹽水注射液，劑量為0.2ml/kg·d，共30天。其余70只大鼠進行造?！?-4】：大鼠右下肢每日肌注苯甲酸雌二醇注射液，劑量為0.5mg/kg·d，25天后，改為肌注射黃體酮注射液，劑量為4.5mg/kg·d，共5天。實驗第31天隨機從造模組和空白組分別抽取10只大鼠，脫臼處死大鼠后，無菌操作剜下其第3對的左側乳房，置于10%的甲醛溶液中固定，包埋切片，HE染色后在光鏡下觀察組織的形態(tài)學變化，觀測造模是否成功。待造模成功后將余60只大鼠按灌服藥物不同隨機分為6組，每組10只，分別為模型組、逍遙丸組、三苯氧胺組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組?？瞻捉M和模型組給生理鹽水0.2ml/kg·d灌胃，其余5組采用灌胃方式給藥，藥物劑量根據(jù)人與動物每公斤體重劑量換算系數(shù)表換算。其中逍遙丸組灌服逍遙丸混懸液0.8g/kg·d；TAM組灌服三苯氧胺水溶劑3.6mg/kg·d；中藥組先灌服I號方10天，低、中、高劑量組分別為11.1g/kg·d、22.2g/kg·d、44.4g/kg·d，后灌服Ⅱ號方20天，低、中、高劑量組分別為9.6g/kg·d、19.2g/kg·d、38.4g/kg·d。

分別于造模后、灌服Ⅰ號方10天后、灌服Ⅱ號方20天后，測量大鼠第3對乳房左側乳頭的直徑。末次灌胃24小時后，脫臼處死大鼠后，無菌操作楔形取下大鼠第3對左側乳房，用10%的中性甲醛溶液固定后分別進行病理切片及免疫組化法檢測 ER、PR、ERK陽性表達。免疫組化法檢測 ER、PR、ERK陽性表達的判斷標準［3］：乳腺的導管及小葉上皮細胞的核和/或胞漿呈現(xiàn)棕黃色著色時判為陽性。未見陽性細胞表達計為（-）；陽性細胞數(shù)小于總數(shù)的20%，而局部見少量較強著色的陽性細胞計為（±）；若陽性細胞率大于20%，依據(jù)陽性細胞的數(shù)目由少到多、著色由淺到深依次計為（+）、（++）、（+++）、（++++）。若計算其陽性率則將（±）同時計入陽性范圍；（-）、（±）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。分別計為 0、1、2、3、4、5分，其積分值愈高，則ER、PR、ERK含量越高。

試驗期間所有實驗動物分籠飼養(yǎng)，室溫24℃～27℃，相對濕度為49%～61%，通風良好，標準飼料，自由進食飲水。

3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，各指標組間采用單因素方差分析。［5-6］

4 結果

4.1 一般情況 與空白組大鼠相比，于造模第12日起，其余各組大鼠開始出現(xiàn)喜聚集、毛發(fā)粗糙、具有攻擊性、乳房色紅，造模結束后出現(xiàn)精神不振、爪涼、易激惹、乳房色紅、透毛可見；用藥后呈現(xiàn)有不同程度的好轉，活動增加，易激惹、乳房紅腫現(xiàn)象基本消失。除空白組外，其余各組間表現(xiàn)無明顯差異。

4.2 用藥前后乳頭直徑的變化

表1 乳頭直徑變化（±s）

表1 乳頭直徑變化（±s）

注：#與空白組比較P＜0.05；*與模型組比較P＜0.05。

灌服Ⅱ方后乳頭直徑（mm）0.92±0.09* 1.33±0.13#1.10±0.08#* 1.14±0.15#* 1.09±0.11#* 1.04±0.08#* 0.90±0.09*組別 例數(shù)空白組模型組三苯氧胺組逍遙丸組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組10 10 10 10 10 10 10造模后乳頭直徑（mm）0.83±0.13* 1.67±0.15#1.65±0.18#1.67±0.13#1.59±0.12#1.65±0.22#1.58±0.17#灌服Ⅰ方后乳頭直徑（mm）0.98±0.14* 1.32±0.13#1.28±0.09#1.36±0.20#1.20±0.16#1.22±0.16#1.26±0.20#

在造模后，各造模組大鼠的乳頭直徑與空白組比較有差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各造模組間差異差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；灌服Ⅰ號方10天后各用藥組大鼠乳頭直徑縮小，但與空白組比較仍有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），各造模組間無明顯差異（P＞0.05）；灌服Ⅱ號方20天后大鼠的乳頭直徑進一步縮小，除中藥高劑量組外，其余各造模組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而各用藥組與模型組比較有差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明造模后大鼠乳頭直徑增大，用藥可使增大的乳頭縮小，尤其是在序貫應用Ⅰ號方、Ⅱ號方，其中又以中藥高劑量組作用最明顯（與空白組比較P＞0.05）。

4.3 乳腺組織ER、PR、ERK的表達強度

4.3.1 乳腺組織ER、PR的表達強度

表4 ER、PR表達積分（±s）

表4 ER、PR表達積分（±s）

注：*與模型組比較P＜0.05

P R組別n E R空白組模型組三苯氧胺組逍遙丸組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組1 . 8 0 ± 0 . 8 4 * 4 . 0 0 ± 1 . 0 0 2 . 2 0 ± 1 . 3 0 * 2 . 4 0 ± 0 . 5 5 * 1 . 6 0 ± 1 . 3 4 * 1 . 8 0 ± 0 . 8 4 * 1 . 6 0 ± 0 . 5 5 * 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 . 2 0 ± 0 . 8 3 * 4 . 0 0 ± 1 . 0 0 2 . 0 0 ± 1 . 2 2 2 . 4 0 ± 0 . 5 5 1 . 8 0 ± 1 . 6 4 1 . 2 0 ± 0 . 4 5 * 2 . 6 0 ± 1 . 8 1

各組大鼠乳腺ER表達積分與模型組相比較均較低，其中以空白組、中藥中劑量組較明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其余各組間相比較差異無統(tǒng)計學意義。說明造模后大鼠乳腺ER表達增強，而使用逍遙丸、三苯氧胺及中藥后可使ER表達減輕，其中以中藥中劑量組效果最明顯。

各組大鼠乳腺PR表達積分與模型組相比較也較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其余各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。說明造模后大鼠乳腺PR表達增強，逍遙丸、三苯氧胺、中藥各組均可降低乳腺增生病模型大鼠乳腺PR的表達。

4.3.2 乳腺組織ERK的表達強度的變化

表5 ERK積分值（±s）

表5 ERK積分值（±s）

注：*與模型組比較P＜0.05；△與三苯氧胺組比較P＜0.05。

ERK 1.90±0.74*3.60±1.17 2.80±0.79 2.60±0.84 2.10±0.99 2.30±0.48 1.90±0.99*△組別空白組模型組三苯氧胺組逍遙丸組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組N 10 10 10 10 10 10 10

與模型組相比較，各組大鼠乳腺ERK表達積分均較低，其中以空白組、中藥高劑量組較明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與三苯氧胺組相比較，中藥高劑量組ERK表達積分較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其余各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義。說明造模后大鼠乳腺ERK表達增強，用藥可使其表達減輕，其中以中藥高劑量組最為明顯，且中藥高劑量組的作用較三苯氧胺組明顯。

5 討論

乳腺增生?。℉yperplasin of Mammary Gland，HMG）是一種非炎非瘤的增生性病變，與內分泌紊亂關系密切，其基本病理變化是乳腺的腺泡、導管及纖維結締組織的增生［4］。HMG的發(fā)病可以是從青春期至絕經期的任一年齡，其中以25～45歲為多見，35～45歲為高峰年齡，約占全部乳腺疾病的70%以上。中醫(yī)稱其為“乳癖”，沖任失調、肝郁腎虛為其發(fā)病之本，血瘀氣滯痰凝為其發(fā)病之標，病屬本虛標實，與肝脾腎三臟［5］密切相關，其癥狀常在月經前明顯加重。

在臨床診療中，武權生教授依據(jù)月經節(jié)律中沖任、胞宮氣血由滿盈、溢瀉至空虛的變化和本病有隨月經周期發(fā)作的特點而分段周期論治。強調“經前勿補，經后勿瀉”的原則，認為經前血海充盈，宜予疏導；經后血?？仗?，宜予調補。臨床治療遵循此規(guī)律周期治療疾病，經前治標，經后固本，常見顯效。因此，針對乳腺增生病在月經的不同時期制定了不同的中藥處方：

I號方重用柴胡疏肝解郁，枳實理氣解郁，泄熱破結，二者共為君藥，疏肝散結為主，一升一降，加強舒暢肝氣之功，肝氣舒，結塊散，乳痛則消。川楝子能理氣而止痛，白蒺藜可疏肝解郁，二藥相伍，疏肝解郁和胃；鱉甲、昆布、海藻軟堅散結，以上共為臣藥，疏肝解郁，軟堅散結。當歸、王不留行活血消腫；夏枯草、全瓜蔞散結消腫亦可清熱，共為佐使，活血、清熱、消腫。諸藥合用，共奏疏肝清熱、軟堅散結之效。II號方中菟絲子、巴戟天、肉蓯蓉補腎陽亦能調補沖任，三者共為君藥，腎氣健，肝氣平，則沖任調。白芍可預防長期用藥耗陰并調沖；當歸甘溫而潤、養(yǎng)血活血，白芍配當歸活血調經、養(yǎng)陰柔肝；柴胡、醋香附、川楝子疏肝解郁；知母、黃柏滋腎陰，以上共為臣藥，補腎柔肝，又肝腎同源，腎氣腎精充足則肝主疏泄的功能得以更好的發(fā)揮。海藻、昆布、夏枯草散結消腫；何首烏補益精血，配夏枯草可散結消腫；元胡活血化瘀、理氣止痛；王不留行活血通經，行血脈，共為佐使，散結消腫，活血止痛。全方共奏疏肝、補腎柔肝、調補沖任之效。兩方緊緊抓住HMG肝氣郁結、痰凝血瘀、沖任失調的病機，配伍精當，根據(jù)HMG的病理特點，攻補兼施，標本兼治而不失側重，做到病愈而不易復發(fā)。

婦女正常乳腺中的雌、孕激素受體高表達與乳腺癌的發(fā)病率升高有關［7-10］，更有學者通過實驗發(fā)現(xiàn)乳腺組織從正常到增生終至癌變的過程中，ER的陽性表達量呈漸進性［7］。ERK2mRNA［8］在乳腺病中表達由強到弱分別為乳腺癌、非典型增生、良性增生、正常乳腺，說明ERK2在乳腺癌發(fā)生整個過程中為活化狀態(tài)，與乳腺增生的發(fā)病有關。本研究表明：乳腺增生大鼠ER、PR、ERK含量明顯升高，而周期治療可抑制雌、孕激素受體的表達，減弱對雌孕激素對靶細胞的敏感性，從而達到治療乳腺增生的目的。

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R305

A

2095-9923（2016）-04

廣西教育廳資助項目（015JK271）;廣西中醫(yī)藥管理局基金項目（2015018）