3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用

黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院神經(jīng)外科，北京101149）

3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用

黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院神經(jīng)外科，北京101149）

3D生物打印技術(shù)是近期在國內(nèi)外興起的一項(xiàng)新的研究技術(shù)，已經(jīng)運(yùn)用到多個(gè)醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域.腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，該病具有易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn)，目前仍有許多研究的瓶頸問題和關(guān)鍵點(diǎn)難以克服.3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面.本文就近期3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用情況做了初步回顧，并就其發(fā)展前景進(jìn)行了展望.

3D生物打??；腦膠質(zhì)瘤；應(yīng)用

1 腦膠質(zhì)瘤的流行病學(xué)與研究難點(diǎn)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，據(jù)四川大學(xué)華西醫(yī)院王翔等［1］統(tǒng)計(jì)，2008～2013年在我國四川省各大醫(yī)院收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，神經(jīng)上皮來源的腫瘤是第一大類腫瘤，占全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的近1／3，其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤占第一位（38.14%），其次分別為彌漫性星形細(xì)胞瘤（15.21%），間變性星形細(xì)胞瘤（8.83%），以及毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（6.57%）等.另據(jù)美國腦腫瘤注冊中心（CBTRUS）統(tǒng)計(jì)顯示［2］，2009～2013年美國40歲以上人群中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤年發(fā)病率為40.10人／每10萬人，年死亡率為8.89人／每10萬人，其中，最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（46.6%），而在19歲以下腦腫瘤患者中，其發(fā)生率可高達(dá)47.4%.該病發(fā)病率、死亡率高，治愈率低，具有高度異質(zhì)性，常為浸潤性生長，邊界不清，治療后常常復(fù)發(fā)，術(shù)后生存期較短，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5年存活率僅為5.5%，接受標(biāo)準(zhǔn)化治療的患者中位生存期僅為14.6個(gè)月，低級(jí)別膠質(zhì)瘤雖然生長緩慢，但有易復(fù)發(fā)和向高級(jí)別進(jìn)展的可能，患者生存期3～5年不等.該病易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的難題仍未完全攻克，這主要是由于膠質(zhì)瘤呈浸潤式生長，難以全部切除，而血腦屏障阻礙了大部分藥物進(jìn)入腫瘤局部發(fā)揮作用的結(jié)果.因此，深入分析膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，精準(zhǔn)地給予腫瘤定位及相應(yīng)治療是當(dāng)前腦膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn).

2 腦膠質(zhì)瘤研究的新技術(shù)

近十年來，膠質(zhì)瘤的診斷和治療技術(shù)得到很大的發(fā)展，產(chǎn)生了包括納米技術(shù)［3］、免疫治療技術(shù)［4］、3D打印技術(shù)［5］、靶向治療技術(shù)［6］等在內(nèi)的許多新技術(shù)，其中，3D打印技術(shù)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視.

3D打印技術(shù)是目前國際上發(fā)展最迅猛的幾項(xiàng)新興技術(shù)之一，被認(rèn)為是引領(lǐng)“第四次工業(yè)革命”的最強(qiáng)推動(dòng)力［7－8］.近年來，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越深入，在生物組織打印、器官模型制作等方面發(fā)展迅速，已有神經(jīng)外科、心臟外科、骨科、肝膽外科、泌尿外科等開始研究制作器官三維立體模型輔助診斷與治療，比如：美國國家醫(yī)療中心專家應(yīng)用該技術(shù)成功構(gòu)建了先天性心臟病患者的心臟模型，外科醫(yī)生利用此模型在術(shù)前對(duì)患者復(fù)雜的心臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的模擬分析，美國密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員利用該技術(shù)3D打印了支氣管支架，并獲得了美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)，成功為1名先天性支氣管軟化癥患兒移植了3D打印支氣管支架，近期還有成功打印椎間盤、主動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)脈瘤等組織器官3D模型的報(bào)道［9－12］.在腦膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域，王振等［13］報(bào)道了應(yīng)用3D打印技術(shù)治療包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的3例腦干腫瘤的臨床研究報(bào)告，他們在術(shù)前對(duì)患者行頭部CTA和MRI檢查，然后把數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics軟件中進(jìn)行3D模型重建，圍繞術(shù)區(qū)構(gòu)建患者腫瘤組織、顱骨、臨近區(qū)域的血管，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)手術(shù)入路，為術(shù)者提供了立體直觀的術(shù)前評(píng)估手段，增加了手術(shù)的安全性.

而3D生物打印技術(shù)則是在常規(guī)3D打印模型的基礎(chǔ)上應(yīng)用3D生物打印機(jī)制作出含有細(xì)胞成分并具有生物學(xué)活性的產(chǎn)品，該技術(shù)的核心是生物磚，即一種新型的、精準(zhǔn)的、具有仿生功能的干細(xì)胞培養(yǎng)體系，它是以種子細(xì)胞（干細(xì)胞、已分化細(xì)胞等）、生長因子和營養(yǎng)成分等多組份組成的“生物墨汁”，再結(jié)合其他材料層層打印出的產(chǎn)品，經(jīng)打印后培育處理，形成具有生理功能的組織結(jié)構(gòu)［5，13－15］.提出細(xì)胞和器官3D打印的“概念之父”是美國克萊姆森大學(xué)托馬斯·波蘭教授，他指導(dǎo)自己的博士生、清華大學(xué)的徐弢教授通過3D打印技術(shù)利用心肌細(xì)胞和特定的生物材料成功打印出一顆能夠有節(jié)奏地跳動(dòng)的心臟；美國韋克福雷斯特大學(xué)團(tuán)隊(duì)近期利用3D生物打印技術(shù)復(fù)制出人造耳朵、骨骼、肌肉等組織器官，成功移植到動(dòng)物體內(nèi)并保持了生物活性；四川大學(xué)華西醫(yī)院康裕建教授團(tuán)隊(duì)采用動(dòng)物自體的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞制備出個(gè)體化的3D生物打印墨汁，在自主研發(fā)的3D生物血管打印機(jī)上成功復(fù)制出具有生物活性的恒河猴自體血管，將該血管通過手術(shù)移植到動(dòng)物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了血管的再生.

目前，3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面［16］.腦膠質(zhì)瘤模型的制作對(duì)于探討該病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，建立新的治療手段，促進(jìn)臨床研究的深入發(fā)展都極為重要.理想的膠質(zhì)瘤模型應(yīng)該具備以下幾個(gè)生物學(xué)特性和化學(xué)特性［17］，即腫瘤的形態(tài)學(xué)特征具有高度一致性，各代的移植瘤與初代接種的腫瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、核分裂相、腫瘤間質(zhì)和血管等結(jié)構(gòu)上高度近似；腫瘤的遺傳學(xué)特征具有高度一致性，傳代移植的腫瘤細(xì)胞染色體與初代接種的腫瘤細(xì)胞染色體要高度近似；腫瘤細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)特征具有高度一致性，各代移植瘤細(xì)胞在細(xì)胞周期、時(shí)相比例、分裂指數(shù)和倍增時(shí)間等方面要高度近似；腫瘤的標(biāo)記物具有高度一致性，移植瘤與初代接種的腫瘤細(xì)胞應(yīng)在一些膠質(zhì)瘤特有生化指標(biāo)的定性或定量方面保持高度近似；駐瘤模型應(yīng)具有高度穩(wěn)定性，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過多次連續(xù)培養(yǎng)傳代后，細(xì)胞存活率與移植成功率高，無自然消退等現(xiàn)象.

近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用多種方式制作了不同的腦膠質(zhì)瘤模型，其中包括：大鼠／小鼠腦膠質(zhì)瘤（C6、9L、T9和F98等細(xì)胞株）模型、裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位（U87R細(xì)胞株）模型、斑馬魚原位膠質(zhì)瘤（U87R細(xì)胞株）模型、低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織塊法原代培養(yǎng)（IDH 1／2突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞株）等［18－20］，但上述模型仍不能很好地模擬膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，其中很重要的一個(gè)因素即目前絕大多數(shù)的研究層面為二維空間，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的空間分布及其相互作用不能完整體現(xiàn)，不能很好地在體或體外構(gòu)建膠質(zhì)瘤生物模型，因此，3D生物打印技術(shù)被引入腦膠質(zhì)瘤模型研究之中.

3 3D生物打印技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究中的初步應(yīng)用

通過基于細(xì)胞和組織的3D生物打印技術(shù)目前主要采用攜帶細(xì)胞的水凝膠3D沉積技術(shù)，直接攜帶細(xì)胞打印這種技術(shù)相比于以往在已成型的支架中種植細(xì)胞，可以獲得更高的細(xì)胞存活率和細(xì)胞密度.Dai等［16］近期采用3D生物打印方式成功將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞培養(yǎng)放置在明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠的基質(zhì)構(gòu)建的模型中，發(fā)現(xiàn)3D生物打印細(xì)胞培養(yǎng)模式下的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞存活率為86.92%，這些腫瘤細(xì)胞保留了原有的遺傳學(xué)特點(diǎn)，還能夠表達(dá)出細(xì)胞特異性的分子標(biāo)記，如血管生成因子VEGF，同時(shí)具有較高的細(xì)胞增殖活性，3D生物打印培養(yǎng)模式的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較2D培養(yǎng)模式具有更強(qiáng)的耐藥性.Loess?ner等［21］也成功運(yùn)用水凝膠材料做為細(xì)胞外基質(zhì)，在體外將腫瘤細(xì)胞構(gòu)建成三維模式.不過，由于膠質(zhì)瘤生物模型中存在細(xì)胞?細(xì)胞間、細(xì)胞?基質(zhì)間、時(shí)間與空間、代謝梯度、機(jī)械阻力等多種因素的相互作用，應(yīng)用3D生物打印技術(shù)復(fù)制腦膠質(zhì)瘤模型仍有許多亟待解決的問題，包括：具有多噴頭的3D生物打印機(jī)的研發(fā)、作為3D打印基質(zhì)的新一代成型材料的探索、腫瘤打印核心區(qū)域細(xì)胞存活率的保持、細(xì)胞生物孵化器的改進(jìn)等.

4 3D生物打印技術(shù)的制約因素與發(fā)展展望

3D生物打印機(jī)是進(jìn)行3D細(xì)胞生物打印的基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外已經(jīng)成型的該類打印機(jī)包括：瑞士RegenHU BIOFACTORY細(xì)胞生物打印機(jī)、Regenvov公司的3D生物打印工作站、新加坡Bio3D Technolo?gies公司的Bio3D Life?Printer細(xì)胞生物打印機(jī)、邁普MP?BIOPRINT3.0細(xì)胞生物打印機(jī)、Organovo公司的NovoGen MMXTM細(xì)胞生物打印機(jī)、藍(lán)光英諾的3D生物血管打印機(jī)等［5，12，22］.這些打印機(jī)主要采用基于噴墨技術(shù)的生物打印工藝，具備可任意定制并自動(dòng)切換的多噴頭系統(tǒng)、多軸運(yùn)動(dòng)平臺(tái)、多區(qū)段溫度控制與壓力調(diào)控等，將細(xì)胞懸液或生物材料作為生物磚（生物墨汁），通過加熱或壓電的方式將打印材料滴出成形，提供細(xì)胞生長所需的微環(huán)境，在一定程度上提高了3D打印細(xì)胞更高的存活率和結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，但這些設(shè)備在生物打印細(xì)胞過程中的可操控性和機(jī)械穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步提升.

作為細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料是影響3D腫瘤生物打印的關(guān)鍵因素之一［23］，細(xì)胞外基質(zhì)形成三維多孔支架空間，提供力學(xué)支撐，使腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移和粘連，促進(jìn)細(xì)胞長入、基因表達(dá).理想的生物材料應(yīng)該具備良好的生物相容性、生物響應(yīng)性、降解性能和力學(xué)特性等，能夠滿足腫瘤細(xì)胞的3D成型支撐，保證模型表面或核心的細(xì)胞具有很高的存活率，目前最常用的明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠基質(zhì)可以初步滿足3D細(xì)胞生物打印要求，但打印在基質(zhì)中的細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系受到一定的影響，天壇醫(yī)院張東團(tuán)隊(duì)與我們近期共同進(jìn)行的研究初步發(fā)現(xiàn)將干細(xì)胞打印種植于海藻酸鹽基質(zhì)表面較種植于該基質(zhì)中具有更高的細(xì)胞存活率，提示目前常用的3D打印基質(zhì)仍有很大的缺陷，尤其是該基質(zhì)在模型后期的支撐性及其對(duì)鈣離子的依賴性對(duì)于細(xì)胞活性的影響仍有待進(jìn)一步解決，因此，尋找新的3D成型支撐材料是該模型研究的關(guān)鍵點(diǎn)之一.

腫瘤模型打印后，需要置入細(xì)胞生物孵化器中進(jìn)一步培育，這種生物孵化器應(yīng)高度近似于腫瘤體內(nèi)生長微環(huán)境，含有各種理化成份與生長因子，由此孕育出的腫瘤模型才能夠更接近體內(nèi)腫瘤.美國NASA發(fā)明了一種旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，通過模擬微重力，將細(xì)胞維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)的懸液環(huán)境，獲得低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，這是一種全新的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模式，該系統(tǒng)較靜態(tài)培養(yǎng)和其他動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式更容易使細(xì)胞分化和維持三維立體結(jié)構(gòu)，有利于目標(biāo)細(xì)胞聚集生長為類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu).而目前國內(nèi)還沒有產(chǎn)生自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞生物孵化器，完全依賴于國外的同類產(chǎn)品.

因此，3D生物打印技術(shù)應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的研究仍任重而道遠(yuǎn)，生物材料學(xué)的進(jìn)步、細(xì)胞生物孵化器的改進(jìn)、3D生物打印機(jī)的發(fā)展是其中幾個(gè)制約發(fā)展的關(guān)鍵因素，在今后的研究中，如果能與包括納米技術(shù)、人工智能技術(shù)、醫(yī)學(xué)仿生工程技術(shù)等在內(nèi)的其他新興技術(shù)相結(jié)合，該技術(shù)將會(huì)有更廣闊的發(fā)展空間.

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Application of 3D bioprinting technology in the research of glioma

HUANG Qing，KANG Hui?Bin，ZHANG Hong?Bing
Department of Neurosurgery，Beijing Luhe Hospital，Capital Med?ical University，Beijing 101149，China

The technology of 3D bioprinting is a new research technique in recent years，and it has been applied to many medical fields.Glioma is one of the most common intracranial tumor，and it has the characteristics of easy recurrence and poor prognosis.There are still many bottlenecks and key points which cannot be overcomed.The application of 3D bioprinting in the study of glioma is still in the initial stage of exploration.And it mainly focuses on simulating the tumor models and detecting the sensitivity and drug resistance of the tumor cells for antineoplastic drugs.This review preliminarily focuses on the aspect of 3D bioprinting，which has been applied in the study of glioma，and provides the prospect for its development.

3D bioprinting；glioma；application

R739.41

A

2095?6894（2017）07?61?03

2017－05－11；接受日期：2017－05－26

首都臨床特色應(yīng)用研究與成果推廣項(xiàng)目（Z171100001017044）；北京市通州區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目國自然攻堅(jiān)專項(xiàng)（KJ2017CX039?10）；北京市通州區(qū)衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)重點(diǎn)課題（TWKY?2016?ZD?01?10）

黃 慶.博士，主任醫(yī)師，副教授.研究方向：神經(jīng)外科.E?mail：doctor＿h(yuǎn)uang＠163.com