MicroRNA?138在膠質瘤中的表達及其功能研究

王 震，劉 楠，劉 輝，張鵬幸，涂艷陽

（第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

MicroRNA?138在膠質瘤中的表達及其功能研究

王 震，劉 楠，劉 輝，張鵬幸，涂艷陽

（第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

目的：探討microRNA?138（miR?138）調控膠質瘤增殖和遷移能力的機制.方法：利用膠質瘤病例分析miR?138與膠質瘤臨床病理之間的關系；利用realtime?PCR檢測膠質瘤細胞U87和U251中miR?138的表達；MTT檢測miR?138對膠質瘤細胞增殖的影響；劃痕實驗檢測miR?138對膠質瘤細胞遷移的影響；Western blot檢測miR?138對hTERT蛋白表達的影響.結果：MiR?138的表達水平與膠質瘤臨床病理密切相關，膠質瘤患者普遍呈現(xiàn)miR?138低表達現(xiàn)象，miR?138在膠質瘤細胞U87和U251中的表達低于正常膠質細胞HEB.過表達miR?138抑制膠質瘤細胞U87和U251的增殖和遷移能力，同時miR?138能夠下調hTERT蛋白的表達.結論：MiR?138通過下調hTERT蛋白的表達抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移，是新的膠質瘤抑癌因子.

MicroRNA?138；膠質瘤；增殖；遷移；hTERT

0 引言

惡性膠質瘤是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點［1］.手術、放化療均不易根治，易復發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國科學家為了解膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段付出了巨大努力，卻始終沒有取得突破性進展，惡性膠質瘤仍是醫(yī)學上未被攻克的一大難題［2－4］.

MicroRNA（miRNA）是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負性基因調節(jié)器調節(jié)多種生物進程.近年來很多報道指出miRNAs調控膠質瘤的多種生物過程，包括膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、干細胞維持以及應激抵抗性等［5］.miRNAs表達水平的改變能夠調控很多基因的表達，既包括原癌基因，也包括腫瘤抑制基因，所以miRNAs既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為原癌基因［6］.miR?138家族是腫瘤中重要的調控因子，miR?138在多種腫瘤中低表達，對胃癌等腫瘤細胞的增殖和轉移起負調控的作用［21］，miR?138還可以抑制頭頸部鱗狀細胞癌的侵襲性并促進其凋亡［18］，說明miR?138與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關.因此miR?138是腫瘤發(fā)生過程中重要的調控因子.目前miR?138的研究已涉及多種腫瘤，但其與膠質瘤的相關研究國內尚未見報道.本研究旨在揭示miR?138對膠質瘤發(fā)生發(fā)展的調控及其作用機制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑兔抗人hTERT多克隆抗體（Santa Cruz公司），多聚賴氨酸（Sigma公司），SP免疫組化試劑盒（北京中杉公司），miRNA抽提試劑盒（TaKa?Ra公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），RT試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），iQ5實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio?Rad公司），DU 800型紫外分光光度計（Beckman公司）.

1.2 病例來源收集第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院2010～2015年膠質瘤手術切除的85例標本.納入標準：診斷經(jīng)病理學檢查證實；手術患者術前未行化療或放療.所有標本獲取均經(jīng)過倫理委員會審核批準.

1.3 細胞培養(yǎng)人神經(jīng)膠質瘤細胞系HEB、U251MG和U87MG購自中國科學院細胞細胞庫，細胞系真實性均經(jīng)過短串聯(lián)重復序列驗證.所有細胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美國），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中國）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國），培養(yǎng)環(huán)境為含5%二氧化碳的37°C細胞培養(yǎng)箱.

1.4 RNA提取用1 mL TRIzol裂解50～100 mg臨床組織標本；冰上用勻漿器反復研磨50次左右，待組織標本研磨至無明顯結塊后轉移到預先標記好的1.5 mL離心管中；向組織勻漿中加入合適體積的氯仿（TRIzol∶氯仿＝5∶1），混勻后室溫靜置 5 min，12 000 r／min離心20 min；離心后水相和有機相發(fā)生明顯分層，小心將上層水相吸出，轉移到新的1.5 mL離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，劇烈震蕩混勻，靜置10 min；然后，4℃、12 000 r／min低溫離心15 min.離心管底可見少量RNA沉淀；小心移取上清，加1 mL左右的750 mL／L的乙醇，12 000 r／min離心15 min；倒掉上清，將離心管倒置酒精完全揮發(fā)，用20 μL DEPC水溶解RNA，震蕩混勻溶解產(chǎn)物；將溶解的RNA進行適當?shù)南♂專ò?∶10），并用分光光度計進行定量.

1.5 轉染將細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)傳代培養(yǎng).細胞采用脂質體法轉染，按說明書進行操作，將脂質體和miR?138 mimics（GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA）混合后無血清條件下孵育細胞，8 h后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng).

1.6 qRT?PCR通過實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測miR?138在神經(jīng)膠質瘤細胞、神經(jīng)膠質瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol（Invitrogen公司，美國）從凍存的組織樣品和細胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）.然后使用B caBest RNA PCR試劑盒（TAKAR公司，中國）來合成cDNA.所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，熒光定量PCR使用SYBR底物，用iQ5實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio?Rad公司）檢測信號.PCR引物序列為：miR?138?RT：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA?TTCAGTTGAGCGGCCTGAT，U6?RT：CGCTTCACGA?ATTTGCGTGTCAT，U6?F：CTC?GCTTCGGCAGCACA，U6?RAACGCTTCACGAATTTGCGT，miR?138?F：ACAC?TCCAGCTGGGAGCTGGTGTTG，GAPDH?F：ACACCC?ACTCCTCCACCTTT，GAPDH?R：TTAC?TCCTTGGAG?GCCATGT.

1.7 MTT實驗將1×104個細胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中，種到96孔板.處理后，培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.棄掉上清，細胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測量490 nm處的OD值.

1.8 Western blotWestern blot實驗步驟根據(jù)BM Chemiluminescence Western Blotting Kit操作說明進行.制好的蛋白樣品，先沸水浴煮5 min，煮完后冰上快速冷卻后離心5 min（12 000 r／min），然后上樣.然后將膠上的蛋白通過電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，400 mA、100 min于冰浴中轉移.用10 g／L酪蛋白封閉液封閉1 h，一抗4℃冰箱孵育過夜（8 h）；一抗孵育完后，用TBST洗滌PVDF膜2次，用封閉液稀釋的二抗（HRP標記的抗兔IgG／HRP標記的抗山羊IgG），孵育PVDF膜1 h（搖床100 r／min，室溫）；將PVDF膜用TBST洗滌，用X光片曝光.

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件（SPSS公司，美國）通過單邊非配對 t檢驗對獨立樣本進行分析.所有統(tǒng)計結果的定量分析均采用標準誤（±SEM）進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 MiR?138與膠質瘤臨床病理關系以85例膠質瘤患者miR?138相對表達量的平均值1.68為界，將85例病例進行臨床病理分析分為miR?138低表達組和miR?138高表達組.結果發(fā)現(xiàn)，在各級別的膠質瘤患者中，miR?138低表達患者明顯多于高表達患者，并且性別、年齡因素對miR?138的表達無顯著影響（表1）.

表1 85例膠質瘤患者miR?138的表達水平與臨床病理特征的關系 ［n（%）］

2.2 MiR?138在膠質瘤細胞中低表達明確了miR?138的表達水平與臨床病理特征的關系之后，需要進一步檢測miR?138在膠質瘤細胞中的表達情況，因此本研究選取正常人腦膠質細胞株HEB和膠質母細胞瘤細胞系U251和U87作為對象檢測分析miR?138在膠質瘤細胞中的表達.結果發(fā)現(xiàn)，miR?138在膠質瘤細胞系U87和U251中的表達水平明顯低于HEB膠質細胞（圖1），該結果進一步證明miR?138在膠質瘤中是低表達的.

圖1 MiR?138在膠質瘤細胞中的表達

2.3 MiR?138過表達抑制膠質瘤細胞增殖MiR?138在膠質瘤組織和細胞中低表達，由此推測miR?138可能在膠質瘤中具有抑癌基因的功能.因此本研究在 U87和 U251中轉染 miR?138 mimics過表達miR?138，并觀察miR?138對膠質瘤細胞增殖的影響.MTT實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)，miR?138過表達對U87（圖2）和U251（圖3）的增殖均起明顯的抑制作用.

圖2 MiR?138對U87細胞增殖的影響

圖3 MiR?138對U251細胞增殖的影響

2.4 MiR?138影響膠質瘤細胞遷移除了增殖實驗，本研究進一步用劃痕實驗檢測miR?138對膠質瘤細胞遷移的影響.結果發(fā)現(xiàn)，劃痕形成24 h后，miR?138過表達后的U87和U251細胞的遷移速度明顯減慢，即miR?138對U87和U251細胞的遷移起抑制作用（圖4）.

圖4 MiR?138對膠質瘤細胞遷移的影響

2.5 MiR?138對細胞周期蛋白表達的影響研究表明，在胃癌中，miR?138可以下調hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被證明與胃癌的發(fā)生及惡性程度相關.因此本研究檢測了在膠質瘤中miR?138對hTERT蛋白表達的影響.結果顯示，在U87和U251兩種細胞中，相對于正常U87和U251細胞以及陰性對照細胞，轉染miR?138后hTERT蛋白的表達顯著下調（圖5），表明在膠質瘤中miR?138可能通過調控hTERT蛋白的表達影響膠質瘤細胞的增殖和遷移.

圖5 MiR?138對hTERT表達的影響

3 討論

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的、預后較差的原發(fā)性惡性腫瘤.由于神經(jīng)膠質瘤呈侵潤性生長，與腦組織無明顯分界，難以做到全部切除，僅通過傳統(tǒng)手術無法有效治愈，多主張聯(lián)合治療，配以化療和放療延緩復發(fā)和延長生存期.即使給予傳統(tǒng)的手術聯(lián)合放、化療的綜合治療方法，低級別膠質瘤患者的平均存活時間僅為3～5年，而高級別膠質瘤患者的平均存活時間為1～2年.因此，尋找新的治療靶點一直是膠質瘤領域的研究熱點.

MicroRNA是一種內源性的單鏈小 RNA（19～25 nt）［7］，無開放閱讀框.作為非編碼的核苷酸，microRNA在許多重要的生命活動過程和疾病中起至關重要的作用［8］.miRNA通過與3'非翻譯區(qū)配對在轉錄水平調節(jié)目標基因的表達［9］.microRNA參與細胞增殖、分化、凋亡以及其他重要的生命活動，而上述功能與神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關［10］.例如，miR?21，miR?7，mir?128和miR?221／22與膠質瘤的惡性發(fā)展［11－12］.有研究［13－17］表明，miR?101在患者腫瘤樣本和細胞系中表達顯著下調，例如肺癌、乳腺癌、喉鱗狀細胞癌、胚胎性橫紋肌肉瘤和膠質母細胞瘤.miR?138還可以抑制頭頸部鱗狀細胞癌的侵襲性并促進其凋亡，通過下調P?糖蛋白、bcl?2、多藥耐藥基因1等逆轉多藥耐藥的白血病細胞.其他研究［18］結果也提示，miR?138可以調節(jié)腫瘤細胞的生長，在腫瘤發(fā)生中起重要調控作用.鑒于miR?138在膠質瘤中的功能報道較少，因此研究miR?138對膠質瘤發(fā)生的影響及調控機理具有十分重要的意義.

已有研究表明，hTERT不但在腫瘤的發(fā)生、生長中起重要作用［19］，最近還被證實能促進腫瘤細胞的遷移能力，與腫瘤轉移密切相關［20］.hTERT可能是miR?138的下游靶基因，在胃癌中，miR?138可以下調hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被證明與胃癌發(fā)生及惡性相關［21］.因此本研究檢測了在膠質瘤中 miR?138對hTERT蛋白表達的影響.研究［21］表明，miR?138在轉錄后水平抑制 hTERT翻譯，miR?138表達水平與hTERT的表達成反比.本研究發(fā)現(xiàn)，miR?138與膠質瘤臨床病理關系密切相關，在各級別的膠質瘤患者中，miR?138低表達患者明顯多于高表達患者，且miR?138在膠質瘤細胞中表達下調.過表達miR?138能夠顯著抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移能力，證明miR?138在膠質瘤中起到抑癌基因的功能.同時在膠質瘤細胞U87和U251中，miR?138能夠顯著下調hTERT的表達，說明miR?138可能是通過下調hTERT蛋白的表達起到抑制膠質瘤細胞生長的作用.綜上所述，miR?138是一個新的膠質瘤抑癌因子，未來可能成為膠質瘤治療的新靶點.

［1］Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917.

［2］Furnari FB，F(xiàn)enton T，Bachoo RM，et al.Malignant astrocytic glioma：genetics，biology，and paths to treatment［J］.Genes Dev，2007，21（21）：2683－2710.

［3］Reitman ZJ，Yan H.Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in cancer：alterations at a crossroads of cellular metabolism［J］.J Natl Cancer Inst，2010，102（13）：932－941.

［4］Wolffe AP，Matzke MA.Epigenetics：regulation through repression［J］.Science，1999，286（5439）：481－486.

［5］Park K，Lee S，Kang E，et al.New generation of multifunctional nanoparticles for cancer imaging and therapy［J］.Adv Funct Mater，2009，19（10）：1553－1566.

［6］Schroeder A，Heller DA，Winslow MM，et al.Treating metastatic cancer with nanotechnology［J］.Nat Rev Cancer，2011，12（1）：39－50.

［7］Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］Cell，2004，116（2）：281－297.

［8］Burnet NG，Lynch AG，Jefferies SJ，et al.High grade glioma：ima?ging combined with pathological grade defines management and pre?dicts prognosis［J］.Radiother Oncol，2007，85（3）：371－378.

［9］Liu X，F(xiàn)ortin K，Mourelatos Z.MicroRNAs：biogenesis and molecular functions［J］.Brain Pathol，2008，18（1）：113－121.

［10］Tavallaie R，De Almeida SR，Gooding JJ.Toward biosensors for the detection of circulating microRNA as a cancer biomarker： an overviewof the challenges and successes［J］.Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2015，7（4）：580－592.

［11］Ohgaki H，Dessen P，Jourde B，et al.Genetic pathways to glioblas?toma：a population?based study［J］.Cancer Res，2005，64（19）：6892－6899.

［12］Furnari FB，F(xiàn)enton T，Bachoo RM，et al.Malignant astrocytic glio?ma：genetics，biology，and paths to treatment［J］.Genes Dev，2007，12（21）：2683－2710.

［13］Zhang J，Liu J，Liu Y，et al.miR?101 represses lung cancer by inhibiting interaction of fibroblasts and cancer cells by down?regula?ting CXCL12［J］.Biomed Pharmacother，2015，74：215－221.

［14］Li JT，Jia LT，Liu NN，et al.MiRNA?101 inhibits breast cancer growth and metastasis by targeting CX chemokine receptor 7［J］.Oncotarget，2015，6（31）：30818－30830.

［15］Li M，Tian L，Ren H，et al.MicroRNA?101 is a potential prognostic indicator of laryngeal squamous cell carcinoma and modulates CDK8［J］.J Transl Med，2015，13：271.

［16］Vella S，Pomella S，Leoncini PP，et al.MicroRNA?101 is repressed by EZH2 and its restoration inhibits tumorigenic features in embryonal rhabdomyosarcoma［J］.Clin Epigenetics，2015，7：82.

［17］Xiaoping L，Zhibin Y，Wenjuan L，et al.CPEB1，a histone?modi?fied hypomethylated gene，is regulated by miR?101 and involved in cell senescence in glioma［J］.Cell Death Dis，2013，4：e675.

［18］Capraro V，Zane L，Poncet D，et al.Telomere deregulations possess cytogenetic，phenotype，and prognostic specificities in acute leuke?mias［J］.Exp Hematol，2011，39（2）：195－202.e2.

［19］陳 陵，陳 婷，蔡永國，等.胃黏膜癌變過程中h TERT和相關基因表達的變化及其臨床意義［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2006，15（5）：443－447.

［20］Yu ST，Chen L，Wang HJ，et al.hTERT promotes the invasion of telomerase?negtive tumor cells in vitro［J］.Int J Oncol，2009，35（2）：329－336.

［21］陳 陵，梁光萍，鄒利全，等.miR?138對人胃腺癌細胞SGC?7901增殖的影響［J］.中國腫瘤臨床，2011，38（13）：755－758.

A study of the expression and function of microRNA?138 in human glioma

WANG Zhen，LIU Nan，LIU Hui，ZHANG Peng?Xing，TU Yan?Yang
Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710038，China

AIM：To study the mechanism of miRNA?138（miR?138）regulating glioma proliferation and migration.METHODS：The relationship between miR?138 and glioma was analyzed.Real?time?PCR was uaed to detect the expression of miR?138 in U87 and U251 glioma cells；MTT was used to detect the effect of miR?138 on glioma cell proliferation；Would healing was used to detect the influence of miR?138 on glioma cell migration；Western blot was used to test the effect of miR?138 on hTERT protein expres?sion.RESULTS：The expression of miR?138 was closely related to the clinical pathology，and glioma patients exhibited miR?138 low expression phenomenon.MiR?138 was lower expression in U87 and U251 glioma cells compared with normal glial cell HEB.MiR?138 inhibited U87 and U251 cell proliferation and migration.At the same time，miR?138 overexpression inhibited the expres?sion of hTERT.CONCLUSION：MiR?138 inhibits glioma cell proliferation and migration through down?regulating the expression of hTERT protein，it may be a new glioma tumor suppression factor.

microRNA?138；glioma；proliferation；migration；hTERT

R739.41

A

2095?6894（2017）07?48?04

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

國家自然科學基金資助項目（81572983）

王 震.碩士.E?mail：wzh?2010＠163.com

涂艷陽.博士，副教授，副主任醫(yī)師.E?mail：tu.fmmu＠gmail.com