肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D通過(guò)負(fù)向調(diào)控有絲分裂誘導(dǎo)基因 6 的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5和 SMMC7721 的增殖和遷移

陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，劉 佳，李培峰

·分子標(biāo)志物·

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D通過(guò)負(fù)向調(diào)控有絲分裂誘導(dǎo)基因 6 的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5和 SMMC7721 的增殖和遷移

陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，劉 佳，李培峰

目的觀察肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 2D(myocyte enhancer factor 2D，MEF2D) 對(duì)肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 增殖和遷移的影響，并探究其是否通過(guò)負(fù)調(diào)控有絲分裂誘導(dǎo)基因 6(mitogen-induced gene 6，MIG6)的表達(dá)發(fā)揮作用。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分別檢測(cè)肝癌細(xì)胞中 MEF2D 和 MIG6 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，以 MEF2D mRNA 表達(dá)量作為橫坐標(biāo)，以 MIG6 mRNA 表達(dá)量作為縱坐標(biāo)，制作線(xiàn)性相關(guān)圖；用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA) 在 PLC/PRF5 細(xì)胞中下調(diào) MEF2D 和 MIG6 后，通過(guò)細(xì)胞增殖與毒性測(cè)定試劑盒(7Sea-Cell Counting Kit，7Sea-CCK) 和細(xì)胞劃痕法檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力；用 siRNA 在 PCL/ PRF5 細(xì)胞中下調(diào) MEF2D、用 MEF2D 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在 SMMC7721 細(xì)胞系中上調(diào) MEF2D 后，通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)法分別檢測(cè) MEF2D 和 MIG6 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)，共分為陰性對(duì)照(negative control，NC)組、siMIG6 組、siMEF2D 組、si2M(同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D)組、空白對(duì)照組、空載對(duì)照組、MEF2D 組 7 組。結(jié)果肝癌細(xì)胞hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、HepG2、7703、Huh7、Bel-7402 中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達(dá)水 平 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.78) 。 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，24 h 和 48 h 時(shí)，下調(diào) MIG6 或 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMIG6 組或siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后，與 siMEF2D 組比較，si2M組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化。 72 h 時(shí)，各組間方差分析差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義 (F=20.68、 P ＜0.01) ；下調(diào) MIG6 后，與 NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)[ 光密度(optical density，OD)值為 3.73±0.18，t=3.84、P=0.02]；下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力顯著下降(OD=1.79±0.22，t=3.95、P=0.02)；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后，與 siMEF2D 組比較，si2M 組中PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(OD=2.99±0.03，t=4.83、P＜0.01)。 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，各組間方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.27、P＜0.01) ；48 h 時(shí)，下調(diào) MIG6 后，與 NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)[細(xì)胞遷移率為(51 ± 4)%，t=3.22、P＜ 0.05)]；下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/ PRF5 細(xì)胞遷移能力顯著下降[細(xì)胞遷移率為(19±3)%，t=7.70、P＜0.01]；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后，與siMEF2D 組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[細(xì)胞遷移率為(46±3)%，t=6.99、P＜0.01]。 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞 MIG6 蛋白表達(dá)水平顯著上升(t= 7.86、P＜0.001)；上調(diào) MEF2D 后，與空載對(duì)照組比較，MEF2D 組中 SMMC7721 細(xì)胞 MIG6 蛋白表達(dá)水平顯著下降(t=4.61、P=0.004)。 結(jié)論 肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 中 MEF2D 和 MIG6 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，MEF2D 很可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控 MIG6 的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 增殖和遷移。

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 2D；有絲分裂誘導(dǎo)基因 6；肝細(xì)胞癌；負(fù)向調(diào)控；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

肝 細(xì) 胞 癌 (hepatocellular carcinoma，HCC) 是 我國(guó)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。目前HCC 的病因和發(fā)病機(jī)制仍未確定，因此努力尋找HCC 治療的特殊靶點(diǎn)，進(jìn)而為腫瘤靶向治療提供新思路尤 為 重 要。 肌 細(xì) 胞 增 強(qiáng) 因 子 2D(myocyte enhancer factor 2D，MEF2D) 最初被認(rèn)為是肌細(xì)胞特異性 DNA 結(jié)合蛋白。 以往研究表明，MEF2D 在肝癌中表現(xiàn)為上調(diào)，而且臨床肝癌樣本中 MEF2D 增高與不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)[1]。 有絲分裂誘導(dǎo)基因 6(mitogen-induced gene 6，MIG6) 是一個(gè)抑 癌 基因， 它的缺失可以加快腫瘤進(jìn) 程[2]。 本課 題組 前期 將肝 癌細(xì)胞中 MEF2D 下調(diào)后進(jìn)行基因測(cè)序并通過(guò) SAS 軟件分析基因芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn) MEF2D 可能參與了對(duì) MIG6轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)控，在肝癌中發(fā)揮重要的作用。 本研究檢測(cè) MEF2D 和 MIG6 在肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 中的表達(dá)情況，觀察下調(diào) MEF2D 和 MIG6后，PLC/PRF5 和 SMMC7721 細(xì)胞增殖和遷移能力變化，并探討 MEF2D 對(duì) MIG6 的負(fù)向調(diào)控作用機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株 7702、PLC/PRF5、SMMC7721、hcclm3、Huh7、 HepG2、 7703、 Bel-7402、 Hela 購(gòu) 自 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和無(wú) 血 清 最 小 必 須 培 養(yǎng) 基 (Opti-Minimal Essential Medium，Opti-MEM)為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；洛斯維-帕克紀(jì) 念 研 究 所 (Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640 培養(yǎng)基為美國(guó) HyClone 產(chǎn)品；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基 (Dulbecco’s mo-dified Eagle medium，DMEM) 為美國(guó) HyClone 產(chǎn)品；MEF2D 和 MIG6的小干 擾 RNA(small interfering RNA， siRNA) 購(gòu) 自中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；空載對(duì)照質(zhì)粒和MEF2D 質(zhì)粒購(gòu)自中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；互補(bǔ) DNA(complementary DNA，cDNA) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)RR047A、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 試劑 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自中國(guó)大連 TaKaRa 公司；質(zhì)粒大抽試劑盒 Endo-Free Plasmid Maxi Kit購(gòu)自美國(guó) Omega 公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司； XfectTM納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自中國(guó)大連 TaKaRa 公司；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(7Sea-Cell Counting Kit，7Sea-CCK)購(gòu)自中國(guó)七海生物公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司； 二辛可寧酸 (bicinchoninic acid， BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司；脫脂奶粉購(gòu)自中國(guó)伊利公司；MEF2D 抗體購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences公司；MIG6 抗體購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH) 抗 體 購(gòu) 自 中 國(guó)博士德生物工程有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志山羊抗兔 IgG 和山羊抗小鼠 IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；ImmobilonTMWestern 發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司。 其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)，共分為陰性對(duì)照(negative control， NC) 組、 siMIG6 組、 siMEF2D 組、si2M(同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D) 組、空白對(duì)照組、空載對(duì)照組、MEF2D 組 7 組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) PLC/PRF5、SMMC7721 細(xì)胞使用 RPMI1640 培 養(yǎng) 基， 7702、 hcclm3、 Huh7、 HepG2、7703、Bel-7402、Hela 細(xì)胞使用 DMEM，細(xì)胞培養(yǎng)液均含 10%FBS，按 100 ∶1的比例加入雙抗，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每 2 d 換 1 次液，并用 0.25%的胰蛋白酶溶液進(jìn)行傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.3.1 siRNA 轉(zhuǎn)染 將 PLC/PRF5 細(xì)胞接種于 6孔板于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá) 70% ～ 80% 時(shí)，更換為 Opti-MEM 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染；用100 μL Opti-MEM 柔 和 混 勻 5 μL siRNA 和 LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑，室溫放置 5 min 后混勻兩者，室溫放置 20 min 形成復(fù)合物；將 200 μL 復(fù)合物加入 6 孔板中，補(bǔ)足 Opti-MEM 至 2 mL，37 ℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng) 48 h 后提取蛋白質(zhì)。

1.2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將 SMMC7721 細(xì)胞接種于 6孔板于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá) 70% ～80%時(shí)，更換新鮮含 10%FBS 的 RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染；用 100 μL Xfect反應(yīng)緩沖液混勻 5 μL 質(zhì)粒和 0.3 μL XfectTM納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑，混合兩者后渦旋數(shù)秒，室溫放置 15 min 形成復(fù)合物；將200 μL 復(fù)合物加入 6 孔板中，補(bǔ)足 RPMI1640 培養(yǎng)液至 2 mL，37 ℃ 、5%CO2條件下培養(yǎng) 48 h 后提取蛋白質(zhì)。

1.2.4 RT-qPCR 收集 Hela、7702、hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、 HepG2、 7703、 Huh7、 Bel-7402 細(xì) 胞， 用Trizol法提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 RT-qPCR 擴(kuò)增，反應(yīng) 體 系 為 20 μL； RT-qPCR 檢測(cè) 細(xì) 胞 中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達(dá)水平。 Hela 細(xì)胞在此被作為陽(yáng)性對(duì)照是因?yàn)樵摷?xì)胞已經(jīng)被驗(yàn)證可以表達(dá)MEF2D[3]。 GAPDH 作為內(nèi)參，每次實(shí)驗(yàn)均做 3 個(gè)重復(fù)孔。 最后以細(xì)胞中的 MEF2D mRNA 表達(dá)量作為橫坐標(biāo)，以 MIG6 mRNA 表達(dá)量作為縱坐標(biāo)，制作線(xiàn)性相關(guān)圖。 引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 7Sea-CCK 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔約2×103個(gè)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染 NC 組、siMIG6 組、siMEF2D 組、si2M 組后，分別于 0、24、48、72 h 檢測(cè)；檢測(cè)時(shí)每孔加入 10 μL 7Sea-CCK 溶液，并確保起始培養(yǎng)體積為100 μL，37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng) 箱 孵 育 1 h， 用酶 標(biāo)儀 檢測(cè)450 nm 處的光密度(optical density，OD) 值，以不含細(xì)胞的等體積空白培養(yǎng)基孔作本底，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于 6 孔板于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá) 70% ～80%時(shí)，使用 200 μL 槍頭比著直尺垂直用力劃?rùn)M線(xiàn)；用磷酸緩沖液沖洗 3 遍后，分別轉(zhuǎn)染 NC 組、si-MIG6 組、siMEF2D 組、si2M 組，加入無(wú)血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；分別于 0、48 h 用倒置顯微鏡觀察遷移效果并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次；應(yīng)用 Image Pro Plus 軟件分別測(cè)量 0 h 和 48 h 時(shí) PLC/PRF5 細(xì)胞劃痕圖的面積和高度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 轉(zhuǎn)染 48 h 后，收集新鮮細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，低溫高速離心 (4 ℃ 、12 000 r/min、30 min) ，提取細(xì)胞總蛋白。 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后，相等蛋白上樣量進(jìn)行 10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯上；加入由 Tris 緩沖鹽溶液和吐溫-20(Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST) 配制的 5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入一抗，4 ℃ 搖床過(guò)夜孵育，TBST漂洗 3 次，每次 10 min；加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂 洗 3 次， 每 次 10 min。 膜 上 滴 加 發(fā) 光液，1 min 后通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)( 法國(guó) Vilber 公司 Solo 4S) 顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次以上；應(yīng)用 ImageJ 軟件測(cè)量灰度值分別檢測(cè) PLC/PRF5 和 SMMC7721細(xì)胞中 MIG6 和 MEF2D 蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間進(jìn)行比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 正常肝細(xì)胞 7702 不表達(dá) MEF2D，肝癌細(xì)胞Bel-7402、Huh7 中 MEF2D mRNA 表達(dá)水平很高，但MIG6 mRNA 表達(dá)水平卻不高；肝癌細(xì)胞 hcclm3 中不表達(dá) MEF2D mRNA，而 MIG6 mRNA 表達(dá)水平卻很高(圖 1)。 線(xiàn)性相關(guān)圖中發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞 hcclm3、SMMC7721、 PLC/PRF5、 HepG2、 7703、 Huh7、 Bel-7402 中 MIG6 mRNA、MEF2D mRNA 表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.78，圖 2)。

2.2 下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 不同時(shí)間點(diǎn)組間單因素方差分析見(jiàn)表 2。 24 h和 48 h 時(shí)，下調(diào) MIG6 或 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMIG6 組和 siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后，與siMEF2D 組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化。 72 h 時(shí)，各組間方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.68、P ＜ 0.01)，下調(diào) MIG6 后，與NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OD=3.73±0.18，t= 3.84、P=0.02)；下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OD=1.79±0.22，t=3.95、P= 0.02)；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后， 與 siMEF2D組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OD=2.99±0.03，t=4.83、P＜0.01)。 見(jiàn)圖 3。

2.3 下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響 各組間方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.27、P＜0.01) 。 48 h 時(shí)，下調(diào) MIG6 后，與 NC 組比較，si-MIG6 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[細(xì)胞遷移率為(51±4)%，t=3.22、P＜0.05]；下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞遷移能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [ 細(xì)胞遷移率為 (19 ± 3)%， t=7.70、 P ＜0.01]；同時(shí)下調(diào) MIG6 和 MEF2D 后， 與 siMEF2D組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[細(xì)胞遷移率為(46±3)%，t= 6.99、P＜0.01]。 見(jiàn)圖 4。

2.4 肝癌細(xì)胞中下調(diào)或上調(diào) MEF2D 后對(duì) MIG6的蛋白表達(dá)水平的影響 肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 中 MEF2D 和 MIG6 的蛋白灰度值見(jiàn)表3、4。 下調(diào) MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中PLC/PRF5 細(xì)胞 MIG6 蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.86、P＜0.001)；上調(diào) MEF2D后，與空載對(duì)照組比較，MEF2D 組中 SMMC7721 細(xì)胞 MIG6 蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.61、P=0.004)。 見(jiàn)圖 5。

3 討論

MIG6 是一個(gè)獨(dú)特的、即刻早期反應(yīng)基因。 它作為一個(gè)接頭蛋白，通過(guò)與上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 胞內(nèi)部分直接結(jié)合來(lái)抑制其酪氨酸激酶酶活性，是 EGFR 通路重要的負(fù)反饋調(diào)控因子[4-5]。 MIG6 在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為下調(diào)，甚至在多種人類(lèi)腫瘤中都表現(xiàn)出高頻率的等位基因缺失[6]。 已有研究表明，MIG6 可以抑制六價(jià)鉻導(dǎo)致的 DNA 損傷且阻止人肺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，降低肺致癌的可能性[7]。 MIG6 也可以作為一個(gè)關(guān)鍵的腫瘤抑制子阻止子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[8]。MIG6 的下調(diào)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及抑制凋亡[9]。 本研究中，下調(diào) MIG6后，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 的增殖能力和遷移能力均顯著增強(qiáng)，說(shuō)明該基因在肝癌中起到一個(gè)抑癌基因的角色。 MEF2D 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 MADS-box 家族，最初被認(rèn)為是肌細(xì)胞特異性DNA 結(jié)合蛋白，多結(jié)合在許多肌特異性基因的調(diào)控區(qū)域控制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在多種發(fā)育和生理過(guò)程中發(fā)揮重要功能[10]。 目前大量的研究已證實(shí)，MEF2D 參與了多種細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。 在白血病中，MEF2D可與其他基因形成融合基因?qū)е氯旧w易位，形成異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促使白血病形成和發(fā)展[11-12]。 在癌細(xì)胞中，MEF2D 還可以受到很多微小RNA(microRNA，miRNA) 的調(diào)控，如在胃癌細(xì)胞中，miR-19 可以抑制 MEF2D 的表達(dá)并抑制 Wnt/β-catenin通路的激活[13]； 在肺 癌細(xì)胞中， miR-218 也可以直接抑制 MEF2D 的表達(dá)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的增殖[14]。除此之外，MEF2D 在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞分化、增殖和存活等方面也發(fā)揮著重要的作用[15-16]。

近幾年，一些 MEF2D 是如何直接調(diào)控腫瘤生物學(xué)功能的研究機(jī)制也陸續(xù)報(bào)道。最近已有研究表明，MEF2D 能將微環(huán)境刺激傳達(dá)給 E 盒結(jié)合鋅指蛋白 1，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[17]；MEF2D 也可以通過(guò)結(jié)合 Pokemon 基因的啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，兩者協(xié)同可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)[18-19]。 然而，MEF2D 與 MIG6 之間的調(diào)控關(guān)系在此之前鮮見(jiàn)報(bào)道。 本研究表明，在肝癌細(xì)胞中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達(dá) 水平 呈現(xiàn) 負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示 MEF2D 和 MIG6 之間可能存在著某種調(diào)控關(guān)系。本研究首先通過(guò)細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了分別下調(diào) MEF2D 或 MIG6 后肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 的增殖和遷移能力，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道保持一致[9]。 然后，在肝癌細(xì)胞 PLC/PRF5 中同時(shí)下調(diào) MEF2D 和 MIG6 后，發(fā)現(xiàn)同時(shí)下調(diào) MEF2D和 MIG6 后消除了單下調(diào) MEF2D 對(duì)肝癌細(xì)胞 PLC/ PRF5 增殖和遷移的抑制能力，表明 MEF2D 與 MIG6之間確實(shí)存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。 最后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行驗(yàn)證，在 PLC/PRF5 細(xì)胞中下調(diào) MEF2D 后，MIG6 的蛋白表達(dá)水平明顯上升；在 SMMC7721 中上調(diào) MEF2D 后，MIG6 的蛋白表達(dá)水平顯著下降。 提示 MEF2D 也許可以通過(guò)結(jié)合 MIG6 基因的啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件來(lái)促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。

在今后的工作中應(yīng)繼續(xù)探討 MEF2D 負(fù)向調(diào)控MIG6 的作用機(jī)制，進(jìn)一步確定 MEF2D 是否結(jié)合并通過(guò) MIG6 啟動(dòng)子上游順式作用元件來(lái)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。 由于 MEF2D 和 MIG6 在腫瘤中起到的關(guān)鍵作用，關(guān)于兩者作用機(jī)制的深入研究對(duì)肝癌的靶向治療具有重大意義。

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Myocyte enhancer factor 2D promotes the proliferation and migration of hepatoma cells PLC/PRF5 and SMMC7721 by negatively regulating mitogen-induced gene 6 expression

CHEN Xiao1， LIN Zhijuan1， LI Mengpeng1， CHEN Chao1， WANG Jianxun1， LIU Jia2， LI Peifeng1
(1.Institute for Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao Shandong 266071， China；2.School of Pharmacy， Qingdao University， Qingdao Shandong 266071， China)

ObjectiveTo study the effects of myocyte enhancer factor 2D(MEF2D)on proliferation and migration of hepatoma cells PLC/PRF5 and SMMC7721， and regulating the expression ofmitogen-induced gene 6(MIG6).MethodsThe mRNA levels of MEF2D and MIG6 were detected by real time fluorescence quantitative PCR in hcclm3， SMMC7721， PLC/PRF5， HepG2， 7703，Huh7， Bel-7402 cell lines and we drew a linear correlation diagram with “ MEF2D mRNA expression” on the horizontal axis and “ MIG6 mRNA expression” on the vertical one in these hepatoma cell lines.The expression of MEF2D and MIG6 were down-regulated by small interfering RNA(siRNA)，then the proliferation and migration were observed by 7Sea-Cell Counting Kit(7Sea-CCK)and wound healing assay in PLC/PRF5 cell lines.The expression of MEF2D and MIG6 were detected by western blot after MEF2D down-regulated by siRNA in PLC/PRF5 cell lines or up-regulated by plasmid in SMMC7721 cell lines.The experimental were divided into seven groups:negative control (NC)group， siMIG6 group， siMEF2D group， si2M(both MEF2D and MIG6 were down-regulated) group ， blank group， empty vector plasmid group and MEF2D group.ResultsWe found that the level of MEF2D mRNA was negatively correlated with expression of MIG6 mRNA in hcclm3，SMMC7721， PLC/PRF5， HepG2， 7703， Huh7， Bel-7402 cell lines(r=-0.78).Next， the results analyzed by 7Sea-CCK showed that the proliferation ability was significantly enhanced at 72 h after siMIG6 treatment compared with NC group in PLC/PRF5 cell lines(OD=3.73±0.18， t=3.84， P= 0.02) ， while there was no change at 24 h and 48 h.However， the proliferation ability was significantly suppressed at 72 h under MEF2D knockdown condition in PLC/PRF5 cell lines compared NC group(OD=1.79 ± 0.22， t=3.95， P=0.02) ， but the proliferation ability was significantly increased at 72 h under MEF2D and MIG6 both knockdown condition compared with siMEF2D group (OD=2.99±0.03， t=4.83， P ＜ 0.01).Furthermore， wound healing assay revealed that the cell mobility in siMIG6 group was significantly increased[cell mobility=(51±4)%， t=3.22， P＜0.05] at 48 h compared with NC group and the cell mobility in siMEF2D group was significantly reduced [cell mobility=(19±3) ， t=7.70， P＜0.01]in PLC/PRF5 cell lines， but the cell mobility in si2M group was significantly increased at 48 h compared with siMEF2D group[cell mobility=(46±3)%，t=6.99， P＜0.01].The result of western blot showed that， compared with NC group， the expression of MIG6 was significantly increased under MEF2D siRNA treatment in PLC/PRF5 cell lines(t= 7.86， P ＜ 0.001) ， while its level was significantly decreased by the elevated level of MEF2D in SMMC7721 cell lines(t=4.61， P=0.004).ConclusionThe expression of MEF2D was negatively correlated with the level of MIG6 of PLC/PRF5 and SMMC7721 cell lines.Thus， MEF2D promotes the proliferation and migration of PLC/PRF5 and SMMC7721 cell lines possibly through negatively regulating MIG6 expression.

Myocyte enhancer factor 2D(MEF2D) ； Mitogenin-duced gene 6(MIG6) ；Hepatocellular carcinoma； Negative regulation； Cell proliferation； Cell migration

Q522；R329.2＋8；R735.7

A

2095-3097(2017)01-0006-07

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.002

2016-12-01 本文編輯:張?jiān)谖?

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81502065)；山東省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(ZR2014HQ009)；中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目(2016T90613)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015M580574)；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目(201602037)；青島市自主創(chuàng)新計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(16-5-1-56-JCH)；青島市博士后應(yīng)用研究項(xiàng)目(2015167)

266071 山東 青島，青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院(陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，李培峰)，藥學(xué)院(劉 佳)

劉 佳，E-mail:dadaliujia＠qdu.edu.cn；李培峰，E-mail:peifli＠qdu.edu.cn