循環(huán)腫瘤DNA檢測在乳腺癌診治中的臨床應(yīng)用

王文彥，王 昕，王 翔（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院乳腺科，北京00050；國家癌癥中心／中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科，北京000）

循環(huán)腫瘤DNA檢測在乳腺癌診治中的臨床應(yīng)用

王文彥1，王 昕2，王 翔2（1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院乳腺科，北京100050；2國家癌癥中心／中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科，北京100021）

乳腺癌是我國女性最常見惡性腫瘤之一，也是我國女性死亡率第二的惡性腫瘤．乳腺癌具有高度異質(zhì)性，目前乳腺癌相關(guān)診療已進入分子分型指導(dǎo)下的個體化診療時代．循環(huán)腫瘤DNA是一種信息量較大、穩(wěn)定，特異性和靈敏度均較高的轉(zhuǎn)移性生物標記，其突變來自腫瘤細胞的體細胞突變，能夠較好地克服腫瘤異質(zhì)性．在乳腺癌領(lǐng)域，循環(huán)腫瘤DNA是近年來的研究熱點，為早期診斷、監(jiān)測療效、探索耐藥等方面提供了循證醫(yī)學(xué)證據(jù)．本研究對循環(huán)腫瘤DNA生物學(xué)特性、檢測方法及其在乳腺癌領(lǐng)域的研究進展進行綜述，并對其今后應(yīng)用作出展望．

乳腺癌；循環(huán)腫瘤DNA；診斷；治療

0 引言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，最新的全國腫瘤登記年報表明，乳腺癌高居我國女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，發(fā)病率為 32．43／10 萬，死亡率 8．62／10 萬，目前已成為女性死亡率第二的惡性腫瘤．其中，城市女性乳腺癌發(fā)病率約為53．87／10萬，農(nóng)村女性發(fā)病率約為40．14／10萬，乳腺癌的發(fā)病率每年遞增約4%［1］．由此可見乳腺癌在我國屬于常見病和多發(fā)病，嚴重影響婦女身心健康，甚至危及生命．乳腺癌的早期診斷、療效隨訪及動態(tài)監(jiān)測一直是臨床及科研工作重點．循環(huán)腫瘤游離 DNA（circulation tumor DNA，ctDNA）是指循環(huán)血液中腫瘤細胞釋放的DNA片段，可以反應(yīng)腫瘤負荷，同時攜帶大量腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)信息［2］．循環(huán)腫瘤DNA的檢測具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性的特點，因此又被稱為“液體活檢”．2015年Nature雜志將“發(fā)現(xiàn)能夠指導(dǎo)乳腺癌治療的分子生物標志物”作為乳腺癌研究的4個重要問題之一［3］，ctDNA成為了近期乳腺癌相關(guān)研究的熱點．本文對ctDNA生物學(xué)特性、檢測方法及其在乳腺癌領(lǐng)域的研究進展進行綜述，并對其今后應(yīng)用作出展望．

1 生物學(xué)特性

ctDNA是由腫瘤細胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA， 是血漿游離DNA （cell?free DNA， cfDNA）的一種，主要來源于壞死的腫瘤細胞及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition， EMT）過程中播散的腫瘤細胞［4］．cfDNA并不是一整條或者隨機進入血液的，它們有自己的載體——核小體．核小體以單個、雙聯(lián)或者三聯(lián)的形式進入血液，并逐步分解．大部分的cfDNA長度約為166 bp．超過90%的健康個體每毫升血漿中的cfDNA量不超過25 ng，而腫瘤患者cfDNA水平明顯升高至180±38 ng／mL，其主要為ctDNA［5］．

ctDNA的半衰期從 0．25小時到數(shù)小時不等．ctDNA的清除過程分為快速清除階段及緩慢清除階段．血漿核酸酶是ctDNA清除過程中的主要核酸酶，但對蛋白復(fù)合體作用有限，因此蛋白復(fù)合體可使ctDNA免于降解，部分腫瘤患者血漿中核酸酶活性降低，導(dǎo)致ctDNA濃度升高［6］．據(jù)報道，健康人血漿中ctDNA含量為3～63 ng／mL，腫瘤患者為122～462 ng／mL，乳腺癌患者ctDNA濃度平均為105．2 ng／mL，高于健康人群，并且患者術(shù)后ctDNA水平明顯下降，平均為59．0 ng／mL．伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的患者血漿ctDNA濃度升高，這提示了ctDNA濃度可能與腫瘤負荷相關(guān)［7］．因此，可以采用無創(chuàng)性檢測 ctDNA，實時監(jiān)測腫瘤患者癌組織狀態(tài)．

2 檢測方法

癌組織中混雜著不同腫瘤干細胞來源的亞克隆及正常組織細胞，因此，組織向血液中所釋放的cfDNA既包括腫瘤來源DNA，也包括正常細胞來源的DNA．提取外周血循壞中的cfDNA指從血漿或血清中提取DNA，其中血清中cfDNA含量高于血漿，然而血清中cfDNA濃度升高主要與血液凝結(jié)過程中白細胞破裂釋放的大量DNA有關(guān)，與腫瘤釋放的ctDNA水平無顯著關(guān)聯(lián)［8］．因此，血漿中提取cfDNA較血清中提取cfDNA更為可靠．cfDNA的濃度隨著靜置時間的延長而顯著增加［9］，因此對樣本的保存時間提出了較高的要求，樣本保存時間不一致可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差．

cfDNA片段大小存在較大差異，提取的方法也不同．目前cfDNA主流的提取試劑盒對比研究發(fā)現(xiàn)，QIAGEN（QIAamp circulating nucleic acid kti）提取率最高．并且，cfDNA定量分析與靶基因相關(guān)，比如TERT基因所測得的濃度比ERV3高出1倍，使用的是GeNorm方法進行多個參考基因分析，通過平均值計算總cfDNA量更為可靠［10］．cfDNA的定量檢測目前尚無統(tǒng)一操作標準，參考STARD制定的cfDNA檢測標準流程使得不同實驗室之間檢測結(jié)果具有可比性［11］．

目前針對ctDNA進行的定性分析包括腫瘤特異突變檢測、基因拷貝數(shù)改變、雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定及甲基化檢測等．傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）靈敏度有限，不能滿足 ctDNA擴增要求．一些經(jīng)過改良的實時定量PCR技術(shù)如擴增組織突變系統(tǒng)、等位基因特異擴增、肽核酸鉗制PCR、雙向焦磷酸水解激活PCR等，可將針對已知突變位點檢測的靈敏度提升至 0．1% ～0．01%［12－13］．新興的數(shù)字液滴 PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)實現(xiàn)了單分子DNA的絕對定量，進一步提高了檢測靈敏度．BEAMing技術(shù)結(jié)合數(shù)字PCR及流式技術(shù)，可對數(shù)以萬計的DNA進行評估［14］．上述技術(shù)具有良好的靈敏度和成本效益，適用于突變位點已知并且數(shù)目較少的情況，此外也可用于檢測甲基化異常．

二代測序（next generation sequencing， NGS）為ctDNA定性分析提供了可靠手段．二代測序不僅能夠確定已知突變，還可以通過全外顯子或基因組測序后與現(xiàn)有癌癥基因數(shù)據(jù)庫進行比對分析發(fā)現(xiàn)未知突變位點并進行個體化監(jiān)測．此外，二代測序還可以對基因拷貝數(shù)變化、基因重排、基因融合等改變進行分析．由于DNA含量低，通常需要在測序前對目標基因進行特異性PCR擴增后再測序，以增加測序準確度，如 TAm?Seq、Safe?SeqS 等方法［15］．新近報道的癌癥個體化深度測序（CAPP?Seq）通過檢索腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）尋找非小細胞肺癌復(fù)發(fā)突變相關(guān)外顯子，再從腫瘤基因圖譜庫（the cancer genome atlas，TCGA）的全基因組測序結(jié)果篩選［16］．研究表明即使ctDNA比例低至0．02%也能夠被檢測到．

3 ctDNA是反映腫瘤遺傳特性的分子標志物

惡性腫瘤與基因突變存在密切的聯(lián)系，基因突變包括點突變、甲基化、基因擴增等多種形式，主要出現(xiàn)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中．致病性突變需要通過活檢或手術(shù)切除腫瘤標本進行檢測，但均屬于有創(chuàng)性檢查．循環(huán)腫瘤DNA具有與腫瘤組織相同的遺傳學(xué)特征，是傳統(tǒng)的基因檢測方法的補充，對于原發(fā)灶已切除的患者，ctDNA可以作為療效監(jiān)測、預(yù)測預(yù)后的指標．Bettegowda等［17］發(fā)現(xiàn)，ctDNA 可在超過75%的轉(zhuǎn)移性胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和肝癌及頭頸癌中檢測到．Oca?a等［18］通過對39個臨床試驗4052名腫瘤患者進行meta分析證實，實體腫瘤患者ctDNA水平高者生存率明顯降低．

ctDNA的突變來自腫瘤細胞的體細胞突變，能夠較好地克服腫瘤異質(zhì)性問題．來源于壞死腫瘤細胞的cfDNA片段更長，因此可以利用較長與較短cfDNA片段數(shù)量的比值，即cfDNA的完整性來評價其中較長片段所占比例．血清cfDNA的完整性在腫瘤體積大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多的患者中明顯升高，在出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移腫瘤患者中也明顯升高［7，19］．Nie 等［20］發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌（non?small?cell lung cancer， NSCLC）中ctDNA與淋巴結(jié)受累具有顯著關(guān)聯(lián)．因此，循環(huán)腫瘤DNA對于腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的評價具有一定的臨床意義．

腫瘤化療的耐藥發(fā)生與基因突變關(guān)系密切．腫瘤患者術(shù)后需要一種無創(chuàng)的活檢方法檢測化療中耐藥的發(fā)生發(fā)展，循環(huán)游離DNA成為目前最好的選擇．Murtaza等［21］對6例癌癥患者進行了連續(xù)血漿標本收集，隨著化療的進行，發(fā)現(xiàn)一些與癌癥發(fā)生及耐藥相關(guān)的基因突變位點的等位基因頻率明顯增加，甚至有一些新的突變位點產(chǎn)生．這證實了腫瘤在化療過程中是不斷變化的，同時也為監(jiān)測癌癥的治療效果、指導(dǎo)用藥提供了可靠的依據(jù)．

循環(huán)腫瘤細胞檢測在腫瘤診斷、療效評價中的應(yīng)用也具有一定的潛力．循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實體腫瘤病灶（原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶）脫落，大部分CTC在進入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險［22］．美國聯(lián)邦藥品監(jiān)督管理局（Federal Drug Association，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準了CTC檢測技術(shù)CellSearch?，用于監(jiān)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌患者［23］．然而，SouthWest腫瘤小組研究發(fā)現(xiàn)，CTC≥5個／7．5 mL的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者與CTC＜5個／7．5 mL的患者相比沒有生存期差異．因此，應(yīng)用CTC檢測評價腫瘤患者預(yù)后仍存在爭議［24］．

與ctDNA相比，CTC檢測提供了完整的腫瘤細胞，能夠應(yīng)用多種DNA、RNA和蛋白質(zhì)組學(xué)測定方法更全面地了解癌癥過程［25］．然而，CTC的使用受到稀釋、分離困難等技術(shù)條件的限制．絕大多數(shù)早期乳腺癌患者中無法檢測到CTC，僅在約20%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中檢測到CTC，極大地限制了臨床應(yīng)用［26］．并且，研究顯示CTC和匹配腫瘤細胞之間存在一定差異，分子生物學(xué)特征研究結(jié)果可靠性不足［27］．鑒于以上問題，ctDNA與CTC相比能夠更好地了解癌癥突變特征．隨著分子技術(shù)的持續(xù)改進，CTC和ctDNA未來將在癌癥臨床管理中相互補充［25］．

4 ctDNA在乳腺腫瘤診治中的研究進展

ctDNA作為一種新的腫瘤標志物，在乳腺腫瘤的診斷、預(yù)后評價、耐藥性監(jiān)測等方面具有廣闊的應(yīng)用前景．目前乳腺癌篩查主要手段是乳腺超聲及鉬靶檢查．然而，儀器限制、臨床經(jīng)驗、影像學(xué)檢查手段可能導(dǎo)致漏診或過度診斷可疑病變［28］．因此，探索靈敏、精確診斷良性和惡性疾病的腫瘤標記物是近年來的研究熱點．

目前，許多研究者希望通過量化ctDNA水平區(qū)分乳腺良惡性疾?。甖anetti?D?llenbach 等［29］使用實時PCR技術(shù)檢測乳腺癌、良性乳腺疾病和健康對照人群中GAPDH基因的血漿和血清ctDNA．與良性疾病或健康對照相比，惡性腫瘤患者血漿中的ctDNA顯著升高，但惡性和良性疾病血清中的ctDNA沒有顯著差異．Catarino等［8］對175例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者及80例健康對照女性的hTERT基因的血漿ctD?NA進行檢測，結(jié)果同樣證實ctDNA在乳腺癌患者中顯著升高 （10．52 vs 77 ng／mL）．Gong 等［30］進一步對GAPDH基因的ctDNA水平進行驗證，對200例乳腺癌、100例良性乳腺疾病和100例健康女性進行檢測，設(shè)定ctDNA臨界濃度為471 ng／mL，乳腺癌診斷敏感性為89%，特異性為94%．Wu等［31］使用定量PCR測量血漿端粒ctDNA水平，與健康對照相比發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者端粒 ctDNA顯著降低，靈敏度為91%，特異性為76%．然而，以上研究結(jié)果受到血清與血漿、量化ctDNA的特異性基因、技術(shù)差異以及腫瘤患者分期等因素影響，研究結(jié)果仍存在一定爭議，因此，單獨使用ctDNA濃度定量篩選和檢測惡性腫瘤仍需謹慎應(yīng)用于臨床中．

一些研究者希望通過檢測ctDNA中腫瘤相關(guān)特異性突變進行癌癥篩查．Chimonidou等［32］在13%～40%的乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA中的CST6啟動子甲基化．Dulaimi等［33］在70%乳腺癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)一種或多種啟動子RASSF1A，APS和DAP激酶的高甲化．Schwarzenbach等［34］使用PCR方法檢測了四種多態(tài)性標志物的雜合性損失（loss of heterozy?gosity，LOH），在19%的乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)了所有標記的LOH．Leary等［35］對10例乳腺癌或結(jié)腸直腸癌患者和10例健康對照組患者的血漿ctDNA進行全基因組分析并測序，使用重排末端的個性化分析（personalized analysis of rearranged ends， PARE），發(fā)現(xiàn)腫瘤患者ctDNA中存在特異性基因結(jié)構(gòu)性改變，例如ERBB2和CDK6的擴增，進一步研究證實來自癌癥患者的所有血漿樣品存在染色體增益或損失．目前，ctDNA中腫瘤特異性突變檢測特異性接近100%，然而經(jīng)濟成本較高．隨著技術(shù)的改進，時間?經(jīng)濟成本的降低將有利于檢測更多突變位點，更加有效地為臨床工作服務(wù)．

Dawson等［36］首次報道了循環(huán)腫瘤DNA在乳腺癌患者預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用．該研究同時應(yīng)用了dPCR及高通量測序，檢測血漿循環(huán)游離DNA中與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的體細胞突變（PIK3CA、TP53等基因突變），攜帶乳腺癌相關(guān)體細胞突變的拷貝被認定是循環(huán)腫瘤DNA．在對30例攜帶PIK3CA、TP53基因突變患者的循環(huán)腫瘤DNA水平進行分析后發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤DNA水平的變化與該患者的治療及預(yù)后情況基本一致．該研究亦將血液中的 ctDNA、CA15?3、循環(huán)腫瘤細胞3個生物學(xué)指標進行了對比，發(fā)現(xiàn)ctDNA檢測的敏感性和特異性均高于后兩者．該研究對于循環(huán)腫瘤DNA的臨床應(yīng)用無疑起到了巨大的促進作用，但由于檢測敏感性低、成本高等原因，ctDNA目前尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床．Garcia?Murillas等［37］對 55位接受手術(shù)和化療的乳腺癌患者的術(shù)后血漿ctDNA進行動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果表明ctDNA比影像學(xué)檢查更早提示腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移．

ctDNA甲基化狀態(tài)的檢測對乳腺癌治療和預(yù)后有一定的價值．甲基化狀態(tài)異常也被認為是癌癥發(fā)生的原因之一．在血清中檢測乳腺癌患者MDR1基因CpG島的甲基化發(fā)現(xiàn)低甲基化水平與腫瘤體積大、分期晚相關(guān)［38］．甲基化狀態(tài)也可作為評價治療效果和預(yù)后的指標之一．在血清中檢測RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)可作為影響他莫西芬療效的獨立因素，攜帶RASSF1A基因甲基化患者的復(fù)發(fā)率和死亡率較高［39］．

乳腺癌的診斷治療已進入分子分型時代，約70%以上的乳腺癌為雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progestogen receptor， PR）陽性，內(nèi)分泌治療已成為乳腺癌綜合治療的重要措施之一．然而，約30%受體陽性的患者存在原發(fā)耐藥，乳腺癌患者內(nèi)分泌治療耐藥機制的問題成為臨床急需解決的重要問題．目前，相關(guān)研究表明雌激素受體α基因（estrogen receptor 1，ESR1）突變是乳腺癌發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥的重要原因之一［40－41］．Chu 等［42］對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者檢測血漿ctDNA中ESR1突變，并對轉(zhuǎn)移灶進行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)ctDNA中ESR1基因突變率超過50%，而由于轉(zhuǎn)移灶組織量不足，僅有30%檢出ESR1基因突變．該研究提示乳腺癌患者監(jiān)測ctDNA可發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌耐藥基因突變，為臨床治療提供一定依據(jù)，對內(nèi)分泌耐藥基因突變的癌癥患者進行早期臨床干預(yù)或許可改善預(yù)后．

約25%中國乳腺癌患者存在HER?2蛋白表達和拷貝數(shù)的增加．HER?2基因擴增的乳腺癌患者，使用靶向治療藥物曲妥珠單抗可以顯著改善預(yù)后．相關(guān)研究表明，血漿中循環(huán)游離DNA可檢出HER?2拷貝數(shù)的增加．Bechmann等［43］利用dPCR對乳腺癌患者循環(huán)游離DNA中HER?2拷貝數(shù)的改變較準確地進行了評價，ROC曲線下面積為0．92．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院馬飛教授團隊應(yīng)用NGS方法對18例HER?2陽性晚期乳腺癌患者ctDNA水平進行監(jiān)測，研究結(jié)果提示，與CT掃描相比，動態(tài)ctDNA檢測在鑒定抗HER?2治療耐藥性方面靈敏度達85．7%，特異性為55．0%，一致率高達 82．1%，進一步證實 ctDNA 檢測是轉(zhuǎn)移性乳腺癌抗 HER?2耐藥性監(jiān)測的重要方法［44］．隨著檢測方法的不斷完善，作為基因診斷的一部分，ctDNA的HER?2拷貝數(shù)檢測可能具有廣闊的臨床應(yīng)用前景．

5 小結(jié)與展望

隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，ctDNA在乳腺癌診療過程中的作用不斷被重視．ctDNA檢測簡便、易行、侵害性小、實時動態(tài)佳等優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注，更全面、深入、動態(tài)地反映著腫瘤的演變過程，顯示預(yù)后、預(yù)測價值的同時展現(xiàn)了早期診斷乳腺癌的臨床價值．但現(xiàn)有研究的證據(jù)力度、檢測技術(shù)等多方面因素在一定程度上限制了其在臨床的推廣應(yīng)用，需要大樣本、前瞻性臨床研究進一步證實對于不同類型、不同階段乳腺癌患者的臨床價值，從而真正實現(xiàn)乳腺癌的分類、個體化、精準治療．

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Clinical application of circulating tumor DNA detection in the diagnosis and treatment of breast cancer

WANG Wen?Yan1， WANG Xin2， WANG Xiang21Department of Breast Surgery，Beijing Tiantan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100050， China；2Department of Breast Surgery， National Cancer Center／Cancer Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100021， China

Breast cancer is one of the most common malignan?cies in women in China，and the second malignancy in female mortality in China．With a high degree of heterogeneity， the current diagnosis and treatment of breast cancer has entered the era of individual diagnosis and treatment under the guidance of molecular classification．Circulating tumor DNA（ctDNA） has been consid?ered to be metastatic biomarkers with large amount of genetic information， which is stable， and has high specificity and sensi?tivity．Its mutations come from somatic mutations of tumor cells，which may better overcome tumor heterogeneity．In the field of breast cancer， ctDNA is a hotspot in recent years．Lots of research on the ctDNA has provided evidence?based medical evidences for early diagnosis， monitoring efficacy， drug resistance and other fields．In this study， we review the biological characteristics detection methods and progress of ctDNA in the field of breast cancer， and make a summary to its further application．

breast cancer； ctDNA； diagnosis； treatment

R737．9

A

2095?6894（2017）09?13?05

2017－03－03；接受日期：2017－03－20

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016?I2M?1?001）

王文彥．博士．研究方向：乳腺腫瘤的綜合治療．

E?mail：wwyan89＠ sina．com

王 翔．教授，主任醫(yī)師，博導(dǎo)．研究方向：乳腺腫瘤．

E?mail：xiangw＠ vip．sina．com