變應(yīng)性鼻炎基因芯片差異表達(dá)研究進(jìn)展△

劉璇 白素娟

·綜述·

變應(yīng)性鼻炎基因芯片差異表達(dá)研究進(jìn)展△

劉璇 白素娟

變應(yīng)性鼻炎(AR)被認(rèn)為是與遺傳及環(huán)境因素有關(guān)的一種病因復(fù)雜的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，其與染色體多位點(diǎn)存在相關(guān)性，因而使AR患者在遺傳學(xué)上有易感傾向。在AR的發(fā)病過(guò)程中，很多研究表明某些相關(guān)基因可能發(fā)揮重要作用?；蛐酒夹g(shù)在人類基因組計(jì)劃的發(fā)展下，以其高通量、微型化、平行化、多樣化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于遺傳相關(guān)性疾病的基因篩選?；贏R的遺傳學(xué)特性，基因芯片技術(shù)也被應(yīng)用于AR。找出發(fā)病的關(guān)鍵基因，可為AR的診治提供新的研究方向。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用及該技術(shù)在AR相關(guān)基因篩選等方面進(jìn)行綜述，有助于對(duì)AR在基因水平的病理生理發(fā)病機(jī)制中有更加深入的了解。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2017，17：65-67)

變應(yīng)性鼻炎；基因芯片；進(jìn)展

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)又稱過(guò)敏性鼻炎，是指特異性個(gè)體接觸變應(yīng)原(花粉、塵螨等)后，由特異性免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子釋放，并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病。其臨床表現(xiàn)以打噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢及眼癢等為主。流行病學(xué)研究表明，AR已成為全球性問(wèn)題，患病率為10%～20%，已成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的健康問(wèn)題[1]。AR被認(rèn)為是上呼吸道免疫調(diào)節(jié)失常的結(jié)果[2-3]，不僅可以引起哮喘，而且成為引起其他疾病的危險(xiǎn)因素之一[4]。

AR是患者接觸變應(yīng)原(如花粉、螨塵等)后，機(jī)體鼻黏膜局部出現(xiàn)的免疫功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，AR的病理過(guò)程涉及合成及釋放多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及多種免疫活性細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞(主要是T淋巴細(xì)胞)、抗原呈遞細(xì)胞(樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)、效應(yīng)細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)等[5]，其中淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T淋巴細(xì)胞在AR的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，具有向輔助T細(xì)胞1(T helper cell 1, Th1)、Th2類細(xì)胞分化的功能，使Th1/Th2類細(xì)胞產(chǎn)生免疫偏移[6-7]。淋巴細(xì)胞亞群中Th1/Th2細(xì)胞的免疫失衡是引起AR的基礎(chǔ)。Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫，Th1細(xì)胞及Th2細(xì)胞在樹(shù)突細(xì)胞調(diào)節(jié)下，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中處于動(dòng)態(tài)平衡，通過(guò)其各自分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)并維持生物體正常功能[8]。在這一過(guò)程中，淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化，促使肥大細(xì)胞釋放IgE，從而引發(fā)機(jī)體變態(tài)反應(yīng)[9]。 AR被認(rèn)為是與遺傳及環(huán)境因素有關(guān)的一種病因復(fù)雜性I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，因其與染色體多位點(diǎn)存在相關(guān)性，故而使機(jī)體對(duì)AR存在易感傾向。目前國(guó)內(nèi)外多著眼于應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)手術(shù)取鼻部組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear ，PBMC)進(jìn)行研究，應(yīng)用基因芯片技術(shù)的可重復(fù)性及高效率性等特點(diǎn)，研究AR的遺傳學(xué)發(fā)病過(guò)程，了解AR相關(guān)基因間的相互聯(lián)系[10]。

1 基因芯片的原理及分類

基因芯片技術(shù)又稱DNA芯片，是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興分子生物學(xué)技術(shù)，屬于生物芯片的一種。主要通過(guò)互補(bǔ)雜交技術(shù)，將一段連接某些特殊物質(zhì)的人工合成核酸探針?lè)诺交蚧旌衔镏?，從而識(shí)別某些特定基因[11]。其基本原理是使用經(jīng)特定波長(zhǎng)激發(fā)而獲得的綠色(Cy5)及紅色(Cy3)熒光標(biāo)記物標(biāo)記基因芯片，然后通過(guò)專業(yè)芯片分析軟件將探針及熒光標(biāo)記物反應(yīng)后的信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信息。通過(guò)生物學(xué)信息分析方法，分析芯片上探針信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度值，得知樣品中的基因表達(dá)水平，篩選出差異基因[12]。按照芯片制備方式不同，其主要分為由Affymerix公司開(kāi)發(fā)的原位合成芯片及斯坦福大學(xué)開(kāi)發(fā)的直接點(diǎn)樣合成芯片2大類；根據(jù)芯片介質(zhì)不同分為玻璃芯片、膜芯片及塑料芯片等;根據(jù)芯片的應(yīng)用區(qū)分為檢測(cè)基因水平的表達(dá)譜芯片、疾病檢測(cè)的診斷芯片及確定基因組中單核苷酸多態(tài)性的SNP芯片3類?；蛐酒夹g(shù)與以往的基因檢測(cè)技術(shù)相比，可以定量或定性檢測(cè)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因。遺傳微環(huán)境細(xì)小的改變，就可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能出現(xiàn)異常，從而激發(fā)機(jī)體疾病。因而基因芯片以其快速、高效等特點(diǎn)可以短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)人體各組織及部位的基因差異表達(dá)異常情況，從而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[13]。

2 基因芯片技術(shù)在AR基因領(lǐng)域的研究應(yīng)用

2.1 AR鼻黏膜組織的基因表達(dá)研究 AR是一種鼻腔的局部黏膜反應(yīng)性病變，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多使用AR患者鼻黏膜組織作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)鼻黏膜基因芯片表達(dá)譜的分析，確定與AR發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。章如新等[14]對(duì)AR患者及非AR患者鼻黏膜組織基因芯片表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，AR差異表達(dá)基因734條，涉及免疫調(diào)控及應(yīng)答、核苷酸反應(yīng)組件調(diào)節(jié)子、人酪氨酸磷酸酶、Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)的G蛋白相配受體、神經(jīng)緊張肽及CCL20等基因在AR患者鼻黏膜芯片中上調(diào)表達(dá)[15]。隨后章如新等[14]進(jìn)一步應(yīng)用基因芯片技術(shù)，對(duì)細(xì)胞因子及其受體在AR及非AR患者鼻黏膜中的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在AR患者鼻黏膜中CCL1、CCL2、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL17、CCL18、CCL19、CCL24及CX3CL1基因上調(diào)，CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR8及CX3CR1等基因受體在鼻黏膜中高表達(dá)，CXCL4低表達(dá)，篩選出了AR相關(guān)基因。發(fā)現(xiàn)AR的顯著上調(diào)基因多為炎性細(xì)胞因子及其受體，其在Th2細(xì)胞參與AR的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，也為AR領(lǐng)域的研究提供了新的診斷思路。有學(xué)者[16-17]發(fā)現(xiàn)，CCL20主要由促炎性因子白細(xì)胞介素1(interleukin 1, IL-1)和IL-13在人氣管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)合成，CCL20以其誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞遷徙，活化T淋巴細(xì)胞趨化蛋白等作用，被認(rèn)為可能為變態(tài)反應(yīng)性疾病的相關(guān)基因。薛金梅等[18]應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)季節(jié)性AR(seasonal AR, SAR)與SAR合并哮喘患者鼻黏膜組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCLl2及其受體CXCR4在SAR合并哮喘患者鼻黏膜組織中顯著上調(diào)。通過(guò)基因芯片這一生物信息學(xué)手段分析得出的生物路徑對(duì)AR的組織、細(xì)胞學(xué)及臨床研究有借鑒意義。

2.2 鼻息肉及AR中的基因表達(dá)研究 AR、鼻息肉、鼻竇炎等鼻腔炎性疾病的主要特征之一是鼻腔黏液分泌異常。紀(jì)琛琪等[19]以鼻腔分泌液中的黏蛋白為樣本制備基因芯片，通過(guò)基因芯片表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)MUC5AC及MUC5B基因在AR及鼻息肉等炎性疾病中顯著增高。Benson等[20-21]對(duì)鼻息肉組織進(jìn)行表達(dá)譜的分析，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，有203個(gè)基因表達(dá)改變，其中已知功能的有139個(gè)，54個(gè)基因下調(diào)，85個(gè)基因上調(diào)；應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出的差異基因，構(gòu)建出AR患者CD4+T淋巴細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)圖，將差異表達(dá)基因編入同一基因網(wǎng)絡(luò)圖，在網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)TNFRSF4在AR實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，從而在基因水平上探討AR的發(fā)病機(jī)制。

2.3 AR外周血基因芯片檢測(cè)及差異表達(dá)研究 李艷青等[22]通過(guò)對(duì)AR與非AR患者PBMC基因表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)CXCL2、CCL22、CCL1、CXCL5等多個(gè)趨化因子及IL-1β、IL-4R、IL-6、集落刺激因子1等致炎性細(xì)胞因子表達(dá)明顯上調(diào)，這些炎性細(xì)胞因子可激活JAK-STAT通路及SOCS系統(tǒng)，在炎性介質(zhì)等方面調(diào)節(jié)AR的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。祝戎飛等[23]通過(guò)分析AR合并支氣管哮喘患者的PBMC基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，351條差異基因中，4倍顯著差異基因有22條，其中主要涉及機(jī)體免疫、機(jī)體代謝、原癌及抑癌基因、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道及運(yùn)輸?shù)鞍椎?。Liu等[24]對(duì)SAR患者在發(fā)病季節(jié)及非發(fā)病季節(jié)外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FOS和JUN及 DUSP1 基因可能在SAR的發(fā)病季節(jié)起著重要作用，KLF4 和 CD163 在SAR的非發(fā)病季節(jié)起著重要作用。劉璇等[25]利用基因芯片技術(shù)分析常年性AR與非AR患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)外周血CD4+T基因表達(dá)譜中顯著上調(diào)的基因ANPEP、TLR8具有調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞分化及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用,從而在基因水平進(jìn)一步證實(shí)了AR發(fā)病過(guò)程中，免疫功能增強(qiáng)及致炎細(xì)胞因子活化等反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)語(yǔ)

基因芯片技術(shù)是高通量、高效及多參量的基因芯片表達(dá)分析平臺(tái)；AR是一種多基因調(diào)控異常性疾?。徊捎没蛐酒夹g(shù)對(duì)AR患者局部鼻黏膜以及PBMC基因表達(dá)譜進(jìn)行差異基因表達(dá)的研究，分析出部分可能與AR發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因，可以為進(jìn)一步深入研究AR的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供新的方向。目前國(guó)內(nèi)外研究多針對(duì)AR患者PBMC。單個(gè)核細(xì)胞，作為機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞之一，大部分由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞組成，其中70%～85%由淋巴細(xì)胞組成，在淋巴細(xì)胞中40%～48%為CD4+T淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群中，T淋巴細(xì)胞亞群的改變已經(jīng)是公認(rèn)的AR發(fā)病原因之一。T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T淋巴細(xì)胞在AR的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位[26]，其具有輔助和誘導(dǎo)作用，被活化后可釋放多種淋巴因子，加速免疫反應(yīng)進(jìn)程。T淋巴細(xì)胞主要由2類細(xì)胞亞群組成，一類為具有輔助和誘導(dǎo)作用的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，另一類為具有抑制和細(xì)胞毒作用的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群，前者被活化后可釋放出多種淋巴因子參與細(xì)胞及體液免疫進(jìn)程。正常情況下，CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群處于動(dòng)態(tài)平衡。CD4+亞群功能增強(qiáng)時(shí)出現(xiàn)超敏反應(yīng)， CD8+亞群功能亢進(jìn)時(shí)表現(xiàn)為免疫缺陷。因而，針對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的研究可以更好地在基因水平上揭示AR的發(fā)病機(jī)制，也為將來(lái)的研究提供了新的方向。

4 展望

人類基因的多態(tài)性在人體對(duì)疾病的易感傾向及耐受性方面起著重要作用。AR是以鼻黏膜為主要反應(yīng)場(chǎng)所的局部變態(tài)反應(yīng)性疾病，在鼻黏膜組織中分選出CD4+T淋巴細(xì)胞，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，使之產(chǎn)生足夠的總RNA制備基因芯片，通過(guò)分析鼻黏膜組織中CD4+T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜，并根據(jù)AR患者臨床表現(xiàn)的多樣性及藥物治療的反應(yīng)性，可以及時(shí)、有效地對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷及預(yù)測(cè)，對(duì)AR患者提供個(gè)性化治療并及時(shí)調(diào)整用藥，或?yàn)锳R的診治提供新的方法。

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(本文編輯 楊美琴)

Research progress on differential expression of genes in allergic rhinitis

LIUXuan,BAISu-juan.

DepartmentofOtorhinolaryngology,thePeople’sHospitalofPutuoDistrict,Shanghai200060,China

BAI Su-juan, Email: baisujuan32@sohu.com

Allergic rhinitis (AR) was an allergic disease, associated with genetic and environmental factors. Because of its correlation with multiple loci of chromosomes, patients with AR had genetic susceptibility. As a new high-throughput platform, gene chip had developed in recent years. It was widely used in the field of medicine related and genetic-related diseases, as its fast, efficient and multi parameter etc. Currently gene chip technology was also used in the screening of genes related to AR. Some key genes related to AR may provide a new direction for the diagnosis and treatment in AR. This review was about the function of gene chip on the application in the medical field and AR. It could bring a deeper understanding of AR at the gene level on pathophysiological pathogenesis. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:65-67)

Allergic rhinitis; Gene expression profile; Trends

上海市普陀區(qū)科委自主創(chuàng)新項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目(普KW15102)

上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200060

白素娟(Email:baisujuan32@sohu.com)

現(xiàn)在中國(guó)人民解放軍第101醫(yī)院耳鼻喉科 無(wú)錫 214000

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.01.021

2016-04-01)