HIF-1α對腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的研究進展

徐丹 陶陶 張繼榮 古麗玲

HIF-1α對腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的研究進展

徐丹 陶陶 張繼榮 古麗玲

缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor -1，HIF-1)是一種在低氧條件下發(fā)揮作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HIF-1蛋白α亞基受細胞內(nèi)氧分壓的影響，常氧條件下HIF-1α被降解而表達很少，低氧條件下HIF-1α被激活而大量表達，通過調(diào)節(jié)其下游多種效應分子的轉(zhuǎn)錄和表達而發(fā)揮作用，HIF-1的生物學功能由HIF-1α決定。腦缺血再灌注時可導致腦組織缺血缺氧，誘導HIF-1α表達上調(diào)，有助于機體更好地耐受低氧環(huán)境而發(fā)揮腦保護作用。本文就HIF-1α對其重要靶基因Bcl-2、Bax及Caspase-3在腦缺血再灌注損傷中的表達和調(diào)節(jié)作用做一綜述，為臨床以HIF-1α基因作為靶點治療腦缺血再灌注損傷提供參考。

缺氧誘導因子-1，α亞基；腦缺血；再灌注損傷；細胞凋亡；bcl-2相關(guān)X蛋白；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是 Semenza等[1]于1992年首次發(fā)現(xiàn)的一種能與促紅細胞生成素基因相結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1 是一種異二聚體復合物，由 HIF-1α和 HIF-1β亞基組成的DNA結(jié)合性蛋白分子。HIF-1β為基礎(chǔ)表達蛋白，主要在細胞核內(nèi)穩(wěn)定表達；HIF-1α則受氧分壓的調(diào)控，正常情況下HIF-1α的半衰期僅約5 min，低氧條件下HIF-1α的降解受到抑制，表達增加并激活下游多種靶基因而發(fā)揮作用，HIF-1 主要通過HIF-1α亞基參與組織細胞對低氧環(huán)境的適應性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，輕度缺氧，即細胞內(nèi)氧濃度在1%～3%范圍時，HIF-1發(fā)揮抑制凋亡的作用；而長期重度缺氧時，即氧濃度在0～0.5%范圍內(nèi)時HIF-1α則大量表達而誘導細胞凋亡[3]。本文對HIF-1α在腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷中抑制凋亡的作用研究進行綜述。

1 HIF-1α與腦I/R損傷

HIF-1α在多種缺血缺氧性疾病與損傷中扮演十分重要的角色，研究表明HIF-1α與腦血管疾病密切相關(guān)[4]。盡管近年來溶栓劑及血管內(nèi)技術(shù)的進展降低了腦缺血的死亡率，但腦I/R損傷仍然是影響腦缺血嚴重程度的重要因素。腦I/R損傷時缺血中心區(qū)腦組織由于血氧供應急劇下降，導致能量供應不足，激活細胞死亡通路，神經(jīng)細胞很快發(fā)生不可逆壞死，而周邊的缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元由于再灌注側(cè)支循環(huán)的建立依然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡以細胞凋亡為主。Tominaga等[5]于1993年首先發(fā)現(xiàn)并證實腦缺血可引起神經(jīng)細胞凋亡，隨后研究人員亦發(fā)現(xiàn)腦缺血早期即可檢測出凋亡細胞，于24 h達高峰[6]。細胞凋亡是涵蓋基因調(diào)控、信號傳導及凋亡效應的執(zhí)行的復雜過程，對機體的生存和穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。

腦缺血使半暗帶的腦血流量下降，減少了該區(qū)的氧供，誘導缺血半暗帶區(qū)HIF-1α積聚活化、表達上調(diào)，有助于腦缺血后半暗帶的血循環(huán)恢復和葡萄糖的運輸、介導缺氧后的低氧適應，對腦組織發(fā)揮著促進細胞存活抑制凋亡的保護作用[4]。由此可見，腦I/R在導致腦組織損傷的同時也啟動了自身的抗損傷機制，這種抗損傷過程可能與HIF-1α的表達上調(diào)有重要聯(lián)系。HIF-1α的分布和作用十分廣泛，但都與其調(diào)控下游靶基因來增強腦組織對缺氧的耐受性有關(guān)。HIF-1α參與調(diào)控的下游靶基因多達100余種，均與能量代謝或供氧有關(guān)，包括促紅細胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)及凋亡相關(guān)基因等，HIF-1α能特異性結(jié)合這些基因上的低氧反應元件(HRE)，通過這些靶基因表達的蛋白產(chǎn)物來啟動機體對缺血缺氧的一系列病理生理機制，如促進血管生成、調(diào)控無氧代謝、促進紅細胞表達增加、幫助細胞增殖遷移分化、抑制細胞凋亡等，從而使缺氧的組織保持氧穩(wěn)態(tài)[2，7]。研究人員對局灶性腦缺血動物模型研究發(fā)現(xiàn)，缺血半暗帶區(qū)HIF-1α表達上調(diào)的同時VEGF表達亦增加，從而促進血管生成來對抗缺血缺氧性損傷，而通過實驗干預減少HIF-1α的降解，則能誘導EPO及 VEGF 表達上調(diào)，明顯提高紅細胞攜氧能力，減輕缺血后腦水腫及血管滲漏[8-9]。缺血腦組織神經(jīng)元存活與否與HIF-1α的穩(wěn)定密切相關(guān)，HIF-1α能在機體受到各種應激狀態(tài)下對抗凋亡，促進神經(jīng)元的存活，發(fā)揮腦保護作用[10]。

2 腦I/R損傷后HIF-1α與Bcl-2、Bax表達

細胞凋亡涉及多種蛋白分子的參與，而Bcl-2家族蛋白是其中不可或缺的一類蛋白質(zhì)，1984年Tsujimoto等[11]從人類B細胞淋巴瘤細胞異位染色體t(14；18)上首次克隆出Bcl-2基因，迄今為止已發(fā)現(xiàn)并確定了Bcl-2家族的25個成員，并根據(jù)其在細胞凋亡中發(fā)揮作用的不同分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類，兩類蛋白相互協(xié)調(diào)以決定細胞是否走向凋亡[12]。生理狀態(tài)下，不同家族成員在各組織中的表達量不盡相同，但其結(jié)構(gòu)非常相似，具有高度同源性。Bcl-2和Bax是家族中最重要的一對調(diào)控細胞凋亡且互相對抗的因子，它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有表達。Bcl-2是家族中的最重要的抗凋亡因子，主要在核膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮作用。Bax則是促凋亡蛋白的典型代表，與Bcl-2的同源性為21%，它以非活性形式分布于胞漿中或細胞骨架上，腦缺血早期神經(jīng)細胞受到凋亡信號刺激后，Bax發(fā)生構(gòu)象改變，從胞漿中轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，使線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放并釋放出細胞色素C，細胞色素C從線粒體釋放至胞漿后與凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和前體Caspase-9結(jié)合形成“Cyto C-Apaf-1-proCaspase-9”凋亡復合體，從而激活前體Caspase-9，活化的 Caspase-9進而激活其下游的前體Caspase-3， Caspase-3通過水解多種蛋白底物而使細胞走向凋亡。細胞色素C還可產(chǎn)生自由基，阻止線粒體產(chǎn)生ATP而誘導線粒體損傷[13]。與此同時Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，從而抑制線粒體釋放細胞色素C，最終抑制Caspase級聯(lián)放大反應而抑制凋亡[14]。隨著I/R時間延長，機體啟動凋亡機制，Bax表達增加使細胞受損加重，Bcl-2被降解而表達下調(diào)。Bcl-2抑制細胞凋亡還可能與它調(diào)節(jié)細胞內(nèi)細胞器的鈣離子流或發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)[15]。研究表明Bcl-2家族蛋白對線粒體釋放細胞色素C具有最明顯而重要的調(diào)控效應[16]。Bcl-2 和 Bax 在細胞中根據(jù)二者的含量不同形成不同的復合物而發(fā)揮截然相反的作用，當Bcl-2的含量高于Bax二者結(jié)合形成異源二聚體時，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用；而當Bax的含量高于Bcl-2而形成Bax同源二聚體時，則促進細胞凋亡[17]。

大量研究證實腦I/R后相互對抗的Bcl-2和Bax的區(qū)域性表達與凋亡細胞具有同步性。Qian等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α表達可使Caspase-9和Caspase-3表達上調(diào)，并抑制PI3K/Akt通路而使Bcl-2表達下調(diào)，降低Bcl-2/Bax比值。總之，腦I/R損傷誘導HIF-1α積聚活化，一方面通過上調(diào)EPO、VEGF及Bcl-2等抑制凋亡，另一方面抑制促凋亡蛋白Bax及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)等，還能產(chǎn)生抗氧化因子等來保護受損的腦組織[19-20]。

3 腦I/R損傷后HIF-1α與Caspase-3

細胞凋亡的實質(zhì)是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程，Caspase家族在細胞凋亡機制中起至關(guān)重要的作用。它們是一組天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，與白介素-1β轉(zhuǎn)換酶(interleukin-1β converting enzyme，ICE)具有同源性，家族成員均以無活性的酶原形式存在。酶原結(jié)構(gòu)包括氨基端的原域，中間的大亞基(P20域)和小亞單位(P10域)3個部分。根據(jù)原域的長度，酶在凋亡途徑中的位置和前體活化方式將Caspase分為兩類：起始者胱天蛋白酶，包括Caspase-8、-9和-10，它們位于級聯(lián)活化反應的上游，由于原域較長而能在凋亡信號的刺激下通過自剪接的方式自我激活，然后順序激活下游Caspase而啟動凋亡；效應者胱天蛋白酶，包括Caspase-3、-6和-7，位于級聯(lián)活化途徑的下游，它們的原域相對較短，必須通過起始者胱天蛋白酶的切割才被激活，活化后可水解胞內(nèi)多種重要的功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，最終使細胞走向凋亡。

Caspases蛋白酶調(diào)控凋亡主要與死亡受體途徑、線粒體依賴途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路有關(guān)。其中，在死亡受體途徑中，死亡受體能與相應的“死亡配體”特異性結(jié)合，將凋亡信號傳入細胞內(nèi)，使Caspase-8在連接分子的媒介下通過自我剪切而活化，經(jīng)過一系列的反應并最終活化Caspase-3，促進細胞凋亡。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)活化的Caspase-8還能降低線粒體內(nèi)膜電位使Bcl-2家族成員裂解，促進線粒體釋放細胞色素C，起到凋亡放大作用[21]。在線粒體依賴中，線粒體內(nèi)釋放細胞色素C是最關(guān)鍵的一步[22]。Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白共同參與了線粒體介導的細胞凋亡途徑。由此可見，Caspase家族是多條凋亡通路的聚集點，是執(zhí)行凋亡的最后通路，Caspase蛋白酶不僅能自我活化還能激活其下游的家族成員，因此凋亡信號通路一旦啟動，即以級聯(lián)放大的形式發(fā)展，直到蛋白底物被裂解，凋亡才結(jié)束。Caspase-3是各種細胞凋亡途徑的必經(jīng)之路，在不同凋亡途徑中扮演“凋亡執(zhí)行者”的角色。在各種凋亡信號刺激下，不同的家族蛋白酶剪切并激活前體Caspase-3，使前體Caspase-3在Asp28-Ser29和Aspl75-Serl76位置處被剪切，形成P20和P10兩個片段，兩種亞單位再結(jié)合形成有活性的Caspase-3，活化的Caspase-3可通過以下3種機制使細胞解體：酶解細胞外基質(zhì)及骨架蛋白、裂解DNA修復蛋白、降解相關(guān)凋亡抑制物[23]。

正常成年大鼠腦組織中通常具有Caspase蛋白酶的抑制劑-X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，防止前體Caspase被偶然激活使組織細胞受損。研究證實腦缺血早期即可在缺血半暗帶區(qū)檢測出大量活化的Caspase-3，與凋亡細胞的表達區(qū)域一致，并于24 h表達最多，提示腦I/R損傷早期細胞凋亡與Caspase-3的激活密切相關(guān)[24]。Caspase-3的異常激活和表達上調(diào)是I/R損傷啟動缺血腦區(qū)受損神經(jīng)元凋亡最重要的環(huán)節(jié)，Caspase-3通過各種途徑參與觸發(fā)腦I/R后的細胞凋亡，而抑制Caspase-3被激活可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護作用[25]。Caspase-3 還可通過水解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去對線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的抑制作用，從而發(fā)揮促進凋亡的發(fā)生[26]。腦缺血時HIF-1α不僅能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax來抑制Caspase-3，還能通過VEGF機制、TNF-α通路及ERKl/2信號通路來調(diào)控Caspase-3的活性，從而抑制Caspase級聯(lián)放大反應，最終減少神經(jīng)細胞損傷[27-28]。

綜上所述，腦I/R損傷后，挽救缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡能有效減少神經(jīng)細胞壞死和神經(jīng)功能缺損。大量動物實驗研究已證實腦組織缺血缺氧可使缺血半暗帶HIF-1α表達增加，由于HIF-1α能調(diào)控下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，因此以HIF-1α作為腦缺血的治療靶點所產(chǎn)生的療效可能比針對單個其下游的靶基因治療更為顯著。值得注意的是，目前對HIF-1α的研究探索還停留在動物模型階段，而且低氧條件下HIF-1α發(fā)揮神經(jīng)保護作用的同時也可能促進凋亡。深入研究HIF-1α及其下游靶基因在腦I/R損傷中的表達和調(diào)控機制，充分發(fā)揮其神經(jīng)保護作用并避免損傷作用，必將為今后的臨床防治提供實際應用價值。

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(本文編輯：時秋寬)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.016

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550002 貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院康復醫(yī)學科〔徐丹(現(xiàn)在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科讀研究生)、陶陶、古麗玲〕；貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科(張繼榮)

陶陶，Email:835707237@qq.com

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A

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2016-12-02)