SMAD6在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的表達(dá)變化

張瑩潔 安娜

SMAD6在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的表達(dá)變化

張瑩潔 安娜

目的 探討母抗Dpp小同源物6 (small mothers against decapentaplegic homolog 6，SMAD6)在β淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的表達(dá)變化。 方法 取孕15～17 d的SD大鼠的胎鼠，進(jìn)行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，經(jīng)不同濃度(10、15、20 μ mol/L)Aβ25-35毒性片段處理后，通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)SMAD6 mRNA表達(dá)水平。取2月齡SD雄性大鼠12只，隨機(jī)分為Aβ注射組和空白對(duì)照組，每組6只。采用雙側(cè)基底前腦注射Aβ1-40建立大鼠癡呆模型，通過(guò)免疫組化及免疫印跡檢測(cè)基底前腦及海馬區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度Aβ25-35處理組海馬神經(jīng)元內(nèi)SMAD6 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組減少(F=602.1，P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Aβ1-40注射組大鼠基底前腦區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)減少(68103±1520比96036±1804；t=20.51，P<0.01)，而海馬區(qū)其表達(dá)增多(96441±1852比55039±1528；t=29.87，P<0.01)；免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Aβ1-40 注射組大鼠基底前腦區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)減少(0.1042±0.0067比1.000±0.0986；t=15.69，P<0.01)，而海馬區(qū)其表達(dá)增多(12.5525±2.6803比1.000±0.0135；t=7.465，P<0.01)。結(jié)論 Aβ可直接下調(diào)神經(jīng)元內(nèi)SMAD6 mRNA轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，不同腦區(qū)內(nèi)SMAD6蛋白表達(dá)可能受負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制影響。

阿爾茨海默病；母抗Dpp小同源物6；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)；β淀粉蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進(jìn)展性神經(jīng)變性疾病，65歲以上患病率達(dá)5%，85歲以上達(dá)20%，病殘、病死率高[1]。AD的主要病理特征為β淀粉樣蛋白(amyloid β protein，Aβ)形成老年斑沉積和異常細(xì)胞骨架形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2]。Aβ具有強(qiáng)神經(jīng)毒性，在導(dǎo)致大量神經(jīng)元變性和壞死之前可先引起神經(jīng)突觸損傷，進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙[3]。母抗Dpp小同源物(small mothers against decapentaplegic homolog，SMAD)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)同屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族中的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等過(guò)程，由8種不同的蛋白構(gòu)成整個(gè)SMAD家族，通過(guò)可逆磷酸化對(duì)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[4]。SMAD6作為一種抑制性SMAD蛋白，通過(guò)減少SMAD2和SMAD5磷酸化，與SMAD4競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制TGFβ/BMP信號(hào)通路[5]。作者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)BMP蛋白在Aβ毒性病變中具有神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]，而作為BMP下游通路中抑制性蛋白SMAD6在Aβ毒性病變中的作用尚不明確。本研究利用原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和癡呆大鼠模型探討了SMAD6在Aβ毒性病變中的表達(dá)變化以及潛在的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠16只，2月齡，體質(zhì)量200～220 g。購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(清潔級(jí)環(huán)境)，動(dòng)物的使用符合上海市動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。將SD大鼠隨機(jī)分為Aβ注射組和空白對(duì)照組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ25-35和阿糖胞苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Trizol試劑購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen 公司。SMAD6抗體(sc-13048)購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司。所有化學(xué)試劑均為分析級(jí)。大鼠立體定向儀、微量推進(jìn)器、顱骨鉆購(gòu)自美國(guó)BAS公司。1 μL微量注射器及手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械公司。Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)由中國(guó)科學(xué)院藥物研究所提供。垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自于美國(guó)BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠膽堿能神經(jīng)元損傷模型：按文獻(xiàn)[6]方法向大鼠雙側(cè)基底前腦Meynert神經(jīng)核注射Aβ進(jìn)行造模。以10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉大鼠，固定于BAS立體定向儀上，將齒棒定為-2.4 mm。前囟后1.4～1.6 mm，旁開(kāi)2.5 mm，鉆顱緩慢進(jìn)針深度7 mm。Aβ注射組采用1 μL的微量注射器和微量推進(jìn)器在雙側(cè)基底前腦Meynert核各注射Aβ1-40(10 μg/μL，Sigma公司)1 μL，注射時(shí)間10 min，注射完畢后，針停留5 min，緩慢拔出，然后以同樣方法注射另一側(cè)[8-9]。對(duì)照組采用等劑量的PBS溶液進(jìn)行注射，方法同上。手術(shù)后第11天開(kāi)始進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)訓(xùn)練，經(jīng)過(guò)5 d水迷宮訓(xùn)練后，采集入水后尋找到平臺(tái)的時(shí)間。造模成功標(biāo)準(zhǔn)以及水迷宮試驗(yàn)結(jié)果作者團(tuán)隊(duì)前期研究，造模成功率100%[6]。水迷宮試驗(yàn)后取大鼠海馬和基底前腦組織凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)：取孕15～17 d的SD大鼠1只(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，無(wú)菌條件下取胎鼠海馬，以0.125%(質(zhì)量濃度)胰蛋白酶消化，加入10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打組織20次，收集細(xì)胞懸液，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱，24 h后換不含血清的培養(yǎng)液(1%谷氨酸鹽+2% B27+97% Neurobasal，Gibco公司)，48 h后加阿糖胞苷，作用24 h后全量換液，此后每3 d半量換液。于培養(yǎng)7～10 d，神經(jīng)元純度達(dá)到80%～90%后用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 提取與擴(kuò)增SMAD6 mRNA：將Aβ25-35溶解于0.1%(質(zhì)量濃度)三氟乙酸溶液中，配成1 mmol/L儲(chǔ)存液，臨用前置于37 ℃孵箱中孵育3 d進(jìn)行老化處理，使可溶性Aβ聚集成不溶性Aβ。將培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為4組，分別用不同濃度Aβ25-35處理海馬神經(jīng)元，使Aβ25-35終濃度分別為10、15、20 μmol/L；另設(shè)立陰性對(duì)照，添加等量三氟乙酸溶液。孵育24 h后采用總RNA提取(total RNA isolation，TRIzol)法提取總RNA。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按Realtime PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Takara公司)。用Bio-Rad定量PCR儀(Bio-Rad公司)設(shè)置預(yù)變性95℃ 10 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s，依據(jù)相應(yīng)的退火溫度持續(xù)30 s，循環(huán)40次。SMAD6和β-actin cDNA基因全長(zhǎng)由Pubmed Genebank查得，委托上海生物工程公司代為設(shè)計(jì)并合成。PCR擴(kuò)增引物如下：SMAD6：上游：5′-CGGGAGAACAGGGTATGA-3′，下游：5′-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′； β-actin：上游：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。SMAD6片段長(zhǎng)度為149 kp，退火溫度54℃；β-actin片段長(zhǎng)度241 kp，退火溫度60℃。PCR產(chǎn)物含量依據(jù)2-△△Ct計(jì)算(其中Ct值代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取均數(shù)。

1.3.4 免疫印跡分析：取Aβ注射組和空白對(duì)照組各3只大鼠凍存大腦組織，研磨制備勻漿。采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，細(xì)胞蛋白提取物在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，麗春紅及考馬斯亮藍(lán)染色。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜浸入5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉的TBST室溫封閉。一抗為兔抗大鼠SMAD6(1∶500)或β-actin抗體(1∶2000，Abcam公司)，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶500，碧云天公司)，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光(electro-chemical luminescence，ECL)試劑盒發(fā)光顯影。采用Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)將光片在白光下掃描后，應(yīng)用Quantity One軟件(Bio-Rad公司)進(jìn)行灰度掃描分析。各組SMAD6相對(duì)含量以SMAD6條帶灰度值與各自β-actin灰度掃描值的比值表示，并設(shè)對(duì)照組。計(jì)算Aβ處理組SMAD6相對(duì)蛋白含量與對(duì)照組的比值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果取均數(shù)。

1.3.5 免疫組化：取Aβ注射組和空白對(duì)照組各3只大鼠腦組織進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，依據(jù)SP試劑盒說(shuō)明書(shū)(Santa Cruz公司)步驟操作。石蠟切片(10 μm)常規(guī)脫蠟，30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2室溫下持續(xù)孵育切片10 min，以滅活內(nèi)源性酶，之后切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫下持續(xù)孵育30 min。滴加稀釋好的兔抗大鼠SMAD6一抗 (1∶500，Abcam公司)，4℃過(guò)夜。滴加生物素化山羊抗兔二抗(1∶500，碧云天公司)，37℃ 20 min后PBS沖洗，DAB顯色。細(xì)胞核內(nèi)呈明確棕色染色者即為SMAD6陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色染色為SMAD6陰性細(xì)胞。選取同一染色條件下的6～7張切片，每張切片隨機(jī)取100個(gè)細(xì)胞，將圖像攝入計(jì)算機(jī)，使

用IMS圖像分析系統(tǒng)(Nikon公司)設(shè)定基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)面積，分別調(diào)定背景、陰性細(xì)胞、陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析，得出陽(yáng)性表達(dá)面積及陽(yáng)性強(qiáng)度均值，按下列公式計(jì)算SMAD6表達(dá)陽(yáng)性指數(shù)：陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性表達(dá)面積×陽(yáng)性強(qiáng)度均值。陽(yáng)性指數(shù)越高表示目標(biāo)蛋白表達(dá)越高。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Phrism 5軟件進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，兩均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠原代海馬神經(jīng)元SMAD6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 10、15、20 μmol/L Aβ處理組以及對(duì)照組原代海馬神經(jīng)元SMAD6 mRNA表達(dá)水平分別為0.1286±0.0050、0.0675±0.0046、0.0189±0.0033、1.0000±0.0654，各組間其表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=602.1，P<0.01)。與對(duì)照組比較，不同Aβ濃度組海馬神經(jīng)元SMAD6 mRNA表達(dá)水平均降低(均P<0.01)。

2.2 各組大鼠不同腦區(qū)SMAD6蛋白表達(dá) (1)免疫印跡分析：與對(duì)照組相比，Aβ1-40注射組大鼠基底前腦區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，而海馬區(qū)其表達(dá)升高(P<0.01)。(2)免疫組化：與對(duì)照組相比，Aβ1-40注射組基底前腦區(qū)內(nèi)SMAD6陽(yáng)性細(xì)胞減少(P<0.01)，而海馬區(qū)則增多(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1～2。

圖1 各組SD大鼠不同腦區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)變化(免疫印跡法)

分組免疫印跡法檢測(cè)SMAD相對(duì)表達(dá)水平基底前腦海馬免疫組化法檢測(cè)SMAD6表達(dá)陽(yáng)性指數(shù)基底前腦海馬Aβ注射組0.1042±0.006712.5525±2.680368103±152096441±1852對(duì)照組1.000±0.0986 1.000±0.013596036±180455039±1528t值15.697.46520.5129.87P值<0.010.010.01<0.01

注：SMAD6：母抗Dpp小同源物6； Aβ：β淀粉樣蛋白。圖1、2同

注：A：正常組基底前腦；B：Aβ注射組基底前腦；C：正常組海馬；D：Aβ注射組海馬 圖2 各組SD大鼠不同腦區(qū)SMAD6陽(yáng)性細(xì)胞(紅色箭頭所示)表達(dá)比較(藍(lán)色箭頭所示為SMAD6陰性細(xì)胞；免疫組化，×200)

3 討論

AD是以漸進(jìn)性的學(xué)習(xí)、記憶、行為和人格障礙為主要臨床特征的神經(jīng)精神疾病，Aβ在腦內(nèi)的沉積是其最典型的病理特征，Aβ具有神經(jīng)毒性，通過(guò)產(chǎn)生氧化應(yīng)激、代謝壓力和興奮性毒性誘導(dǎo)神經(jīng)元損害[10]。BMPs最初為軟骨內(nèi)骨形成的誘導(dǎo)劑和骨代謝的調(diào)節(jié)劑，由胞漿分泌后進(jìn)入細(xì)胞間隙，與細(xì)胞膜上的BMPs受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)相結(jié)合,激活BMP下游信號(hào)，包括經(jīng)典的SMAD及非經(jīng)典的LIM激酶1(LIM kinase 1，LIMKl)等。SMAD6是一種抑制性SMAD蛋白，可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合I 型BMPR或SMAD4蛋白，從而抑制SMAD1/5/8磷酸化或者核轉(zhuǎn)移，從而下調(diào)BMP信號(hào)系統(tǒng)[11]。 本研究選擇10、15和20 μ mol/L濃度的Aβ25-35處理培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，結(jié)果顯示Aβ25-35直接處理海馬神經(jīng)元可導(dǎo)致SMAD6 mRNA轉(zhuǎn)錄減少；進(jìn)一步采用Aβ1-40注射建立膽堿能神經(jīng)元損傷模型，通過(guò)免疫組化和免疫印跡方法檢測(cè)基底前腦區(qū)和海馬區(qū)SMAD6蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Aβ1-40對(duì)基底前腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生直接神經(jīng)毒性，導(dǎo)致SMAD6蛋白表達(dá)降低，這與Aβ25-35直接作用于原代海馬神經(jīng)元導(dǎo)致SMAD6 mRNA表達(dá)水平降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示Aβ可直接引起SMAD6 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)降低。作者課題組前期研究應(yīng)用水迷宮試驗(yàn)證實(shí)，Aβ1-40雙側(cè)注射大鼠基底前腦區(qū)可導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生記憶認(rèn)知功能障礙[6]，Aβ可導(dǎo)致SMAD6的上游通路BMP6、BMP7及BMP4蛋白含量下降[6-7]，而作為BMPs下游通路中的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，SMAD6蛋白水平與上訴3種蛋白的變化一致，似乎是一個(gè)矛盾的結(jié)果。Mouillesseaux 等研究結(jié)果顯示，BMP2可誘導(dǎo)SMAD6蛋白表達(dá)增加，當(dāng)BMPs信號(hào)通路打開(kāi)時(shí)，通過(guò)SMAD途徑和非SMAD途徑影響遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[11]。經(jīng)典的SMAD途徑最終可以作用于細(xì)胞核，影響B(tài)MPs的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白SMAD6的基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)BMPs信號(hào)通路增強(qiáng)時(shí)，SMAD6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)會(huì)隨之增強(qiáng)。BMPs誘導(dǎo)的SMAD6蛋白增加是BMPs信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制之一：SMAD6可抑制SMAD1/5/8蛋白與共享SMAD4蛋白形成復(fù)合體；同時(shí)SMAD6可抑制非SMAD通路中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶1-絲裂原活化蛋白激酶(TGF activated kinase 1-mitogen activated protein kinase, TAK1-MAPK)信號(hào)途徑；SMAD6還可促進(jìn)BMPR的降解[11-12]。SMAD6作為BMPs的下游信號(hào)，伴隨BMPs的變化而變化，從而起到負(fù)反饋平衡的作用。BMPs信號(hào)途徑除SMA6外，還存在多種調(diào)節(jié)因子，包括BMPs拮抗劑noggin、chordin、follistatin等以及抑制性SMAD7蛋白和SMAD磷酸酶，它們均在不同傳導(dǎo)通路上發(fā)揮作用[13-14]，SMAD6是經(jīng)典的SMAD信號(hào)途徑在細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抑制性SMAD蛋白，不僅與BMPs同步變化，而且在維持BMPs信號(hào)穩(wěn)定上有重要作用。上述研究結(jié)果提示，在一定強(qiáng)度和時(shí)間范圍內(nèi)的Aβ毒性刺激可以激發(fā)BMPs/SMAD6信號(hào)通路的自我調(diào)節(jié)功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有雙向聯(lián)系的特征，基底前腦和海馬區(qū)之間正是具有雙向投射纖維[15]，這可以解釋海馬區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)升高的原因?；浊澳X膽堿能系統(tǒng)包括腹側(cè)紋狀體、杏仁核、Meyner核、隔核及斜方體，隔核海馬膽堿能投射纖維終止于海馬區(qū)神經(jīng)元。同時(shí)，海馬區(qū)神經(jīng)纖維元投射到隔閡的外側(cè)區(qū)和內(nèi)側(cè)區(qū)，從而反饋海馬區(qū)的信息[16]。本研究采用Aβ1-40注射基底前腦區(qū)建立大鼠模型，其海馬區(qū)SMAD6蛋白表達(dá)升高，推測(cè)海馬區(qū)SMAD6蛋白上調(diào)是由于基底前腦區(qū)SMAD6下調(diào)的負(fù)反饋?；浊澳X區(qū)神經(jīng)元受到Aβ1-40的毒性攻擊，使該區(qū)域神經(jīng)元受損嚴(yán)重，可直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)合成SMAD6的功能下降。本實(shí)驗(yàn)中Aβ注射區(qū)為基底前腦，海馬區(qū)未直接受到Aβ毒性攻擊，與基底前腦區(qū)相比，海馬區(qū)受毒性攻擊的程度和時(shí)間均會(huì)削弱，同時(shí)結(jié)合腦區(qū)間存在雙向調(diào)節(jié)作用，故作者推測(cè)海馬區(qū)SMAD6因負(fù)反饋而代償性增多。本研究結(jié)果與既往研究BMP6/BMP7/BMP4在AD病變中作用的結(jié)果相似，均表明存在海馬區(qū)與基底前腦區(qū)的雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)[6-7,17]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Aβ可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)SMAD6 mRNA轉(zhuǎn)錄的下降，誘導(dǎo)大鼠注射區(qū)-基底前腦內(nèi)SMAD6蛋白表達(dá)下調(diào)，提示SMAD6可能參與AD病變；基底前腦和海馬區(qū)SMAD6蛋白的表達(dá)可通過(guò)負(fù)反饋的方式進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，這為研究AD發(fā)病機(jī)制提供了一種潛在的思路。

[1]Jack CR Jr, Knopman DS, Jagust WJ, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer’s pathological cascade [J]. Lancet Neurol, 2010, 9 (1): 119-128.

[2]Tamayev R, Matsuda S, Arancio O, et al. β- but not γ-secretase proteolysis of APP causes synaptic and memory deficits in a mouse model of dementia [J]. EMBO Mol Med, 2012, 4 (3): 171-179.

[3]Davis RC, Marsden IT, Maloney MT, et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin-phosphorylation [J]. Mol Neurodegener, 2011, 6 (24): 10.

[4]龐莉，王晶，蔣延文.Smad蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2013,10(12):155-158.

[5]Hayashi Y, Hsiao EC, Sami S, et al. BMP-SMAD-ID promotes reprogramming to pluripotency by inhibiting p16/INK4A-dependent senescence [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2016, 113(46): 13057-13062.

[6]Sun L, Guo C, Liu D, et al. Protective effects of bone morphogenetic protein 7 against amyloid-beta induced neurotoxicity in PC12 cells [J]. Neuroscience, 2011, 184(1): 151-163.

[7]Sun L, Guo C, Wang T, et al. LIMK1 is involved in the protective effects of bone morphogenetic protein 6 against amyloid-β-induced neurotoxicity in rat hippocampal neurons [J]. J Alzheimers Dis, 2014, 42 (2): 543-554.

[8]Bao XM, Shu SY. The rat brain in stereotaxic coordinates [B]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 1991.

[9]Bishop KM. Therapeutic potential of CERE-110(AAV2- NGF): targeted, stable, and sustained NGF delivery and trophic activity on rodent basal forebrain cholinergic neurons [J]. Exp Neurol, 2008, 211 (2): 574-584.

[10]Annunziata I, Patterson A, Helton D, et al. Lysosomal NEU1 deficiency affects amyloid precursor protein levels and amyloid-β secretion via deregulated lysosomal exocytosis [J]. Nat Commun, 2013, 4 (1): 2734.

[11]Mouillesseaux KP, Wiley DS, Saunders LM, et al. Notch regulates BMP responsiveness and lateral branching in vessel networks via SMAD6 [J]. Nat Commun, 2016, 11(7):13247.

[12]Lee YS, Park JS, Jung SM, et al. Inhibition of lethal inflammatory responses through the targeting of membrane-associated Toll-like receptor 4 signaling complexes with a Smad6-derived peptide [J]. EMBO Mol Med, 2015, 7(5):577-592.

[13]Brazil DP, Church RH, Surae S, et al. BMP signalling: agony and antagony in the family [J]. Trends Cell Biol. 2015, 25(5):249-264.

[14]Fortini BK, Tring S, Plummer SJ, et al. Multiple functional risk variants in a SMAD7 enhancer implicate a colorectal cancer risk haplotype [J]. PLoS One,2014, 9(11):e111914.

[16]Gyengesi E, Andrews ZB, Paxinos G, et al. Distribution of secretagogin-containing neurons in the basal forebrain of mice, with special reference to the cholinergic corticopetal system [J]. Brain Res Bull, 2013, 94 (5):1-8.

[17]安娜、孫琳.股形態(tài)發(fā)生蛋白4在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的表達(dá)變化[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2015,22(4)：233-236.

(本文編輯：時(shí)秋寬)

The change of SMAD6 expression in Aβ-induced neurotoxicity

ZHANGYingjie,ANNa*.

*ShanghaiMentalHealthCenter,ShanghaiJiaotongUniversity,SchoolofMedicine,Shanghai200030,China

Corresponding author: AN Na, Email: nanaan1978@126.com

Objective To investigate the change of small mothers against decapentaplegic homolog 6(SMAD6) expression in amyloid β(Aβ)- induced neurotoxicity. Methods 15-17 days of pregnant SD mice were used for the experiment. Hippocampal neurons from the brain of fetal rats were treated with different concentrations of Aβ25-35 (10，15，20 μmol/L) for 24 h. The mRNA level of SMAD6 in rat hippocampal neurons after Aβ25-35 treatment was assayed through Realtime PCR. Twelve SD rats with the age of 2 months old and the weight of 200～220 g, were divided into an Aβ injection group and a control group.Invivo, Aβ 1-40 was bilaterally injected into the basal forebrain to simulate neuropathological processes of Alzheimer’s disease (AD), and the levels of SMAD6 protein were explored in the regions of basal forebrain and hippocampus. Results Result of Realtime PCR showed that the levels of SMAD6 mRNA in the Aβ group significantly decreased compared with the control group(F=602.1，P<0.01). Immunohistochemisty results showed that SMAD6 protein was significantly decreased in the Aβ group relative to the control group in the basal forebrain(68103±1520vs. 96036±1804；t=20.51，P<0.01), while there was an opposite change in the hippocampus(96441±1852vs. 55039±1528；t=29.87，P<0.01). Western blot results showed that SMAD6 protein was significantly decreased in the Aβ group relative to the control group in the basal forebrain(0.1042±0.0067vs. 1.000±0.0986；t=15.69，P<0.01), while there was an opposite change in hippocampus(12.5525±2.6803vs. 1.000±0.0135；t=7.465，P<0.01). Conclusions Aβ directly down-regulates SMAD6 expression, and there may be negative feedback regulation of SMAD6 among different brain regions.

Alzheimer’s disease; small mothers against decapentaplegic homolog 6; bone morphogenetic proteins; amyloid beta protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.008

100088首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院13病區(qū)(張瑩潔)；200030上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)附屬精神衛(wèi)生中心老年科(安娜)

安娜，Email：nanaan1978@126.com

R749.1

A

1006-2963(2017)03-0183-05

2016-09-04)