XPG基因表達(dá)用于法醫(yī)學(xué)年齡推斷

鄧小冬，張偉，張波，馬英，木爾扯爾，章麗霞，謝英，劉云

（1.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川南充 637000）

XPG基因表達(dá)用于法醫(yī)學(xué)年齡推斷

鄧小冬1，張偉1，張波1，馬英2，木爾扯爾1，章麗霞1，謝英1，劉云1

（1.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川南充 637000）

目的探討著色性干皮病G組（xeroderma pigmentosum group G，XPG）基因在不同年齡段健康漢族人群中的表達(dá)情況，分析XPG mRNA和蛋白表達(dá)量與年齡之間的相關(guān)性，以期為法醫(yī)學(xué)年齡推斷提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)。方法收集150名不同年齡段健康漢族人的外周血樣，采用TRIzol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)XPG mRNA在PBMC的相對(duì)表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)XPG蛋白在血漿中的表達(dá)量。結(jié)果XPG mRNA及其蛋白表達(dá)量在≤18歲組與19～45歲組之間、≤18歲組與≥46歲組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但19～45歲組與≥46歲組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。XPG mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)性別差異（P＞0.05）。結(jié)論XPG mRNA在PBMC的相對(duì)表達(dá)量在低齡段內(nèi)隨年齡增加而下降，其血漿中蛋白隨年齡增加而升高；XPG基因有望成為法醫(yī)學(xué)年齡推斷的新型指標(biāo)之一。

法醫(yī)遺傳學(xué)；法醫(yī)人類學(xué)；著色性干皮病G組；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；年齡推斷

為克服形態(tài)學(xué)方法推斷個(gè)體年齡的局限性，近年來(lái)利用分子生物學(xué)技術(shù)探尋法醫(yī)學(xué)年齡推斷的新型指標(biāo)引起研究者的廣泛關(guān)注，主要集中在端粒長(zhǎng)度變化、線粒體DNA損傷、氨基酸外消旋法、DNA甲基化程度等[1-5]，但以上研究多為趨勢(shì)化分析，缺乏定量研究。因此，積極探尋年齡推斷的新指標(biāo)，建立與年齡相關(guān)的數(shù)學(xué)模型至關(guān)重要。

研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，著色性干皮病G組（xeroderma pigmentosum group G，XPG）在DNA損傷修復(fù)中扮演著重要角色。一方面，XPG基因是核苷酸切除修復(fù)（nu-cleotide excision repair，NER）通路的限速酶，具有特異性核酸內(nèi)切酶活性，切除損傷DNA的3′端[6]；另一方面，XPG基因在堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）途徑中激活DNA糖基化酶參與修復(fù)氧化應(yīng)激所致的DNA損傷[7]。NER和BER是DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中最重要的修復(fù)途徑，故XPG基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平可在一定程度上反映DNA損傷修復(fù)能力或效率。近年來(lái)，研究[8-9]報(bào)道DNA損傷修復(fù)能力隨著年齡增加而逐漸下降，其中NER和BER途徑最為突出。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10-11]發(fā)現(xiàn)XPG基因缺陷模型小鼠出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，認(rèn)為XPG基因缺陷嚴(yán)重影響DNA修復(fù)能力及其活性，導(dǎo)致體內(nèi)蓄積大量有害物質(zhì)，阻礙基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，影響基因組的穩(wěn)定性，加速了機(jī)體衰老。因此，推測(cè)XPG基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平與年齡存在一定相關(guān)性。本研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）檢測(cè)XPG mRNA在不同年齡段健康漢族人群外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)XPG蛋白在血漿中的表達(dá)水平，分析XPG mRNA及其蛋白表達(dá)量與年齡之間的相關(guān)性，為建立XPG基因表達(dá)與年齡之間的數(shù)學(xué)模型奠定基礎(chǔ)，以期為法醫(yī)學(xué)年齡推斷提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采集健康漢族人群外周血樣150份，其中男性73例，女性77例；年齡≤18歲50例、19～45歲70例、≥46歲30例。以上樣本均來(lái)源于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心和產(chǎn)科住院部（所有樣本的采集均為知情同意）。

1.2 主要儀器及試劑

7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AB公司），Benchmark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），NanoDrop 2000紫外分光光度儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。2×Taq PCR MasterMix試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，Human XPG ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司），人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），RNAiso Plus試劑（日本TaKaRa公司），PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（日本TaKaRa公司）。RT-qPCR引物采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件自行設(shè)計(jì)（表1），所用引物由日本TaKaRa公司合成。

表1 XPG基因和β-actin基因RT-qPCR引物序列

1.3 總RNA提取、鑒定及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

用人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC，按RNAiso Plus操作說(shuō)明書提取總RNA。采用NanoDrop 2000紫外分光光度儀測(cè)定總RNA純度和濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性。選取純度高、完整性好的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser）操作說(shuō)明書分兩步逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 XPG mRNA在PBMC中相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按2×Taq PCR MasterMix試劑盒操作說(shuō)明書擴(kuò)增XPG和內(nèi)參β-actin基因，瓊脂糖凝膠電泳確定模板cDNA的質(zhì)量及引物特異性；根據(jù)目標(biāo)條帶大小分別切下XPG和β-actin基因電泳條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說(shuō)明書純化PCR產(chǎn)物；將純化后的PCR產(chǎn)物（標(biāo)準(zhǔn)品）用純水10倍梯度稀釋6個(gè)濃度，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒操作說(shuō)明書建立PCR反應(yīng)體系和條件，并在7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上制作XPG和βactin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR擴(kuò)增體系：SYBR Green Mix 10 μL，DyeⅡ0.4 μL，上下游引物（pmol/μL）各0.8 μL，標(biāo)準(zhǔn)品（PCR純化產(chǎn)物）2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃15 s預(yù)變性；95℃5 s，60℃30s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行融解曲線分析，融解條件：95℃15s，60℃30s，95℃15s，1個(gè)循環(huán)。

1.4.2 XPG mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取待測(cè)樣本的cDNA溶液2.0μL，加入與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完全相同的PCR體系中，與標(biāo)準(zhǔn)品在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本復(fù)孔3個(gè)，并設(shè)定無(wú)cDNA樣品的空白管作為陰性對(duì)照。用7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得出目的基因（XPG基因）和內(nèi)參基因（β-actin基因）的Ct值及相關(guān)曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 XPG蛋白在血漿中表達(dá)量的檢測(cè)

按Human XPG ELISA試劑盒操作說(shuō)明書在Benchmark酶標(biāo)儀上檢測(cè)并收集待測(cè)樣本的光密度（D）值。以調(diào)整后的標(biāo)準(zhǔn)品D值為橫坐標(biāo)（x），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得擬合曲線方程式，將待測(cè)樣品的D值代入方程式即可求得血漿中XPG蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR擴(kuò)增特異性與擴(kuò)增效率

熔解曲線顯示β-actin和XPG基因擴(kuò)增片段的熔點(diǎn)分別為86.0℃和85.9℃，熔解曲線呈單峰，峰形窄而尖，無(wú)雜峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線是10倍梯度稀釋?duì)?actin和XPG后進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成，其擬合優(yōu)度（R2）分別為0.9952和0.9998，斜率分別為-3.3394和-3.5271，直線擬合度好，PCR反應(yīng)體系和條件適宜，可在較寬廣范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

XPG蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合優(yōu)度（R2）為0.999 5；曲線擬合方程為y=1.1769x2+2.3859x+0.2527。

2.3 XPG mRNA在不同年齡段PBMC中的表達(dá)水平

XPG mRNA在不同年齡段PBMC中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。經(jīng)檢驗(yàn)，XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在≤18歲組與19～45歲組之間、≤18歲組與≥46歲組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但19～45歲組與≥46歲組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 XPG mRNA在PBMC中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2 XPG mRNA在PBMC中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：1）與≤18歲組比較，P＜0.05

組別例數(shù)mRNA相對(duì)表達(dá)量年齡≤18歲502.3772±0.2355 19～45歲701.1605±0.13551）≥46歲301.2570±0.23281）性別男731.5721±0.1714女771.5273±0.1624

2.4 XPG蛋白在不同年齡段血漿中的表達(dá)水平

XPG蛋白在不同年齡段血漿中的表達(dá)量見(jiàn)表3。XPG蛋白表達(dá)量在≤18歲組與19～45歲組之間、≤18歲組與≥46歲組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但19～45歲組與≥46歲組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，XPG蛋白表達(dá)量在性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 XPG蛋白在血漿中的表達(dá)量（±s）

表3 XPG蛋白在血漿中的表達(dá)量（±s）

注：1）與≤18歲組比較，P＜0.05

組別例數(shù)蛋白表達(dá)量年齡≤18歲310.2820±0.0121 19～45歲370.4162±0.03261）≥46歲200.4646±0.06301）性別男410.4120±0.0393女470.3520±0.0210

2.5 XPG基因表達(dá)水平與年齡的相關(guān)性

回歸分析結(jié)果顯示，XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量與≤45歲年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.811，P＜0.05）。以年齡為自變量（x），mRNA表達(dá)量為因變量（y），擬合曲線為y=0.001 x2-0.116 2 x+3.439 9（R2=0.760 4，P＜0.05）。然而，XPG蛋白表達(dá)量與≤45歲年齡呈正相關(guān)（r= 0.662，P＜0.05）；以年齡為自變量（x），蛋白表達(dá)量為因變量（y），擬合曲線為y=0.000075x2+0.0005x+0.2017（R2=0.336 4，P＜0.05）。XPG mRNA和蛋白表達(dá)量與≥46歲年齡相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在低齡段間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且回歸分析顯示XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在低齡段內(nèi)隨年齡增加而下降，說(shuō)明XPG mRNA表達(dá)量與年齡有關(guān)，其機(jī)制可能是：（1）XPG基因作為NER通路的限速酶，其mRNA隨年齡下降，導(dǎo)致NER修復(fù)能力降低，引起體內(nèi)有害物質(zhì)的大量蓄積，上調(diào)p53基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，激活p21CIP1/WAF1基因表達(dá)使細(xì)胞周期停止在G2期，造成DNA合成與復(fù)制受阻，抑制細(xì)胞增殖，最終出現(xiàn)衰老、死亡[12]。研究[6]報(bào)道，XPG基因敲除小鼠和XPG基因定點(diǎn)突變小鼠均出現(xiàn)早衰、體質(zhì)量下降（為正常小鼠的60%）和神經(jīng)退行性變等現(xiàn)象，且XPG基因敲除小鼠生存時(shí)間明顯低于定點(diǎn)突變小鼠，兩者體內(nèi)均堆積大量紫外線損傷產(chǎn)物，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimer，CPD）和6-4光產(chǎn)物（6-4 photoproduct，6-4PP），表明XPG基因缺失或突變引起NER修復(fù)能力明顯下降，致使CPD和6-4PP等產(chǎn)物蓄積，最終導(dǎo)致機(jī)體早衰。（2）XPG mRNA表達(dá)下降的原因可能與基因突變有關(guān)。研究[8-13]發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞NER修復(fù)能力每年降低約0.61%，其DNA突變能力每年增長(zhǎng)約0.6%。XPG基因常見(jiàn)多態(tài)性可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄區(qū)或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)直接或間接影響XPG基因轉(zhuǎn)錄水平或穩(wěn)定性，下調(diào)其mRNA表達(dá)水平，從而降低NER修復(fù)能力，最終啟動(dòng)衰老途徑[12]。（3）XPG基因甲基化程度可影響其mRNA表達(dá)。有研究[14-15]報(bào)道，XPG基因啟動(dòng)區(qū)甲基化能阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子（增強(qiáng)子）結(jié)合而抑制mRNA表達(dá)，導(dǎo)致NER修復(fù)能力降低。因此，隨著年齡的增加，XPG mRNA表達(dá)水平和NER修復(fù)能力均下降，相互之間形成惡性循環(huán)，影響細(xì)胞增殖和基因組穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老。

本研究前期運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)PBMC中XPG mRNA表達(dá)水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)XPG mRNA相對(duì)表達(dá)量在≤45歲年齡段與年齡呈負(fù)相關(guān)。為此，我們從不同年齡段中隨機(jī)抽取部分血漿樣本檢測(cè)XPG蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示XPG蛋白表達(dá)水平在≤45歲年齡段與年齡呈正相關(guān)，與XPG mRNA表達(dá)水平不一致，且呈截然相反的現(xiàn)象。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究繼續(xù)從不同年齡段隨機(jī)選取血漿樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，但結(jié)果依然沒(méi)有改變，其原因可能與XPG蛋白翻譯過(guò)程中或翻譯后加工及修飾異常有關(guān)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞生物mRNA與蛋白水平相關(guān)性僅為0.09～0.46，mRNA水平僅能解釋40%蛋白水平，另外60%受其他因素調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄后翻譯效率的改變[18]。隨著年齡增加機(jī)體內(nèi)分泌功能或內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，可能刺激并提高了XPG蛋白翻譯效率[18-19]，最終出現(xiàn)了XPG蛋白不降反升的現(xiàn)象，但具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究予以明確。

XPG mRNA和蛋白表達(dá)水平在≤45歲年齡段內(nèi)與年齡相關(guān)性較好，而在≥46歲年齡段，其mRNA和蛋白表達(dá)水平與年齡相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明XPG基因在年齡增加到某個(gè)時(shí)間段后，其mRNA和蛋白表達(dá)將趨于穩(wěn)定。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能與以下因素有關(guān)：（1）本研究高齡組納入樣本量相對(duì)較少，可能造成統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚；（2）XPG mRNA和蛋白表達(dá)可能具有時(shí)序特異性，即只有到某一階段其表達(dá)才會(huì)相對(duì)穩(wěn)定[18]；（3）XPG基因經(jīng)過(guò)早期體內(nèi)外有害物質(zhì)的預(yù)適應(yīng)，隨著年齡增加可能產(chǎn)生了適應(yīng)性表達(dá)，即XPG基因在45歲左右表達(dá)趨于穩(wěn)定[20-21]。未來(lái)需加大樣本量并從基因表達(dá)調(diào)控方面深入研究XPG基因表達(dá)規(guī)律。

回歸分析顯示，XPG mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平與年齡（≤45歲）均呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，XPG mRNA的相對(duì)表達(dá)量與年齡（≤45歲）呈負(fù)相關(guān)（r= -0.811），XPG蛋白血漿中表達(dá)量與年齡（≤45歲）呈正相關(guān)（r=0.662），且均不受性別差異的影響；其擬合曲線分別為y=0.001x2-0.1162 x+3.4399（R2=0.7604， P＜0.05）、y=0.000075x2+0.0005x+0.2017（R2=0.3364，P＜0.05）。故認(rèn)為XPG mRNA和蛋白表達(dá)水平均有望成為≤45歲年齡段法醫(yī)學(xué)年齡推斷的有效指標(biāo)之一。但本研究實(shí)際運(yùn)用于法醫(yī)學(xué)年齡推斷時(shí)存在一定局限。首先，本研究樣本量相對(duì)較少，尤其是≥46歲組，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚；其次，人群結(jié)構(gòu)較單一，僅納入本地區(qū)漢族人群，不宜推廣到所有人群中運(yùn)用；另外，本研究隨機(jī)選取不同年齡段部分血漿樣本檢測(cè)XPG蛋白表達(dá)水平，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，未來(lái)需在明確XPG基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加大樣本量、豐富人群結(jié)構(gòu)、細(xì)化年齡分組，深入研究XPG基因與年齡的關(guān)系，以便建立更好的數(shù)學(xué)模型應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。

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Expression of XPG Gene in Forensic Age Estimation

DENG Xiao-dong1,ZHANG Wei1,ZHANG Bo1,MA Ying2,MUER Che-er1,ZHANG Li-xia1,XIE Ying1, LIU Yun1
（1.Department of Forensic Medicine,North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China;2.Department of Neurology,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China）

ObjectiveTo explore the expression of xeroderma pigmentosum complementation group G（XPG）gene in healthy Han population of different ages and to analysis the relationship between the mRNA and protein expression levels of XPG and age,which may provide a new molecular-biological indicator for forensic age determination.MethodsTotal 150 samples of peripheral blood were collected from healthy Han population of different ages.Total RNA of peripheral blood mononuclear cell（PBMC）were extracted by TRIzol method,and the relative expression of XPG mRNA in PBMC was detected by quantitative real-time PCR,and the protein expression levels of XPG in plasma were detected by ELISA.ResultsThe mRNA and protein expression levels of XPG in≤18 years old group were significantly different from 19-45 years old group and≥46 years old group（P＜0.05）,while there was no significant difference between 19-45 years old group and≥46 years old group（P＞0.05）.No significant sex differences were observed in mRNA and protein expression levels of XPG（P＞0.05）.ConclusionThe relative expression level of XPG mRNA in PBMC declines with the increase of age in younger age,while the protein expression level in plasma increases with age,and XPG gene can be used as one of new markers for forensic age estimation.

forensic genetics;forensic anthropology;xeroderma pigmentosum group G;quantitative realtime PCR;enzyme linked immunosorbent assay;age estimation

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.005

1004-5619（2016）06-0415-05

2015-12-11）

（本文編輯：李莉）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81400966）；四川省教育廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZA0191，15ZA0209）

鄧小冬（1988—），男，碩士，助教，主要從事法醫(yī)學(xué)研究；E-mail：857123409＠qq.com

劉云，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)毒理學(xué)研究；E-mail：xyun2005＠163.com