大鼠血液中HbCO隨吸入CO濃度和時(shí)間的變化

陳慶，白潔，李長(zhǎng)榮，張文芳

（北京市公安局法醫(yī)檢驗(yàn)鑒定中心，北京 100192）

大鼠血液中HbCO隨吸入CO濃度和時(shí)間的變化

陳慶，白潔，李長(zhǎng)榮，張文芳

（北京市公安局法醫(yī)檢驗(yàn)鑒定中心，北京 100192）

目的研究不同一氧化碳（carbon monoxide，CO）濃度下中毒大鼠的行為學(xué)特征、存活時(shí)間、碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，HbCO）飽和度變化規(guī)律，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中CO中毒死亡案件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將160只SD大鼠隨機(jī)分為4組。自制染毒裝置，使大鼠分別在CO濃度為1250、3750、6250mg/m3及持續(xù)通入CO狀態(tài)下染毒致死亡。觀察不同CO濃度中毒大鼠的行為學(xué)特征，記錄存活時(shí)間，采用分光光度法檢測(cè)心血HbCO飽和度，并提取腦、心臟、肺、肝等器官進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果CO中毒大鼠的行為學(xué)特征表現(xiàn)為肢體癱軟、反應(yīng)遲鈍。隨著CO濃度的升高，大鼠存活時(shí)間逐漸縮短，心血HbCO飽和度逐漸升高。在CO濃度為1250mg/m3條件下，發(fā)現(xiàn)3例心血HbCO飽和度明顯低于致死飽和度，其余各組未發(fā)現(xiàn)心血HbCO飽和度低于致死飽和度的情況。結(jié)論建立的不同濃度下CO中毒死亡動(dòng)物模型，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究CO中毒及其他吸入性有毒氣體的法醫(yī)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

法醫(yī)病理學(xué)；碳氧血紅蛋白；一氧化碳中毒；模型，動(dòng)物；大鼠

一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中十分常見(jiàn)的死亡原因之一，在我國(guó)尤以北方冬季常見(jiàn)。國(guó)外統(tǒng)計(jì)資料[1]表明，在中毒的自殺、他殺及意外死亡案件中，CO作為單項(xiàng)毒物居多，甚至占據(jù)首位。

關(guān)于CO中毒的碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，HbCO）致死飽和度、尸體現(xiàn)象等均早已被法醫(yī)工作者所熟知，然而在實(shí)際檢案中卻經(jīng)常遇到特征性尸體現(xiàn)象不明顯、血液中HbCO飽和度遠(yuǎn)低于致死飽和度（50%以下）等問(wèn)題，給CO中毒死亡的判定帶來(lái)一定困難，并引發(fā)很多爭(zhēng)議。因此，本研究通過(guò)建立不同CO濃度中毒動(dòng)物模型，觀察大鼠中毒后的行為學(xué)特征，研究其存活時(shí)間、HbCO飽和度變化規(guī)律，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中CO中毒死亡案件，尤其是非典型性CO中毒死亡案件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年SD大鼠160只，雌雄各半，體質(zhì)量（300±50）g。隨機(jī)分為4組，每組40只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)，自由飲水，按CO的濃度分為A組（1 250 mg/m3）、B組（3 750 mg/m3）、C組（6 250 mg/m3）及D組（持續(xù)通入CO）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒模型的制備

染毒裝置為長(zhǎng)1.0m、寬0.8m、高0.6m的密閉透明塑料染毒箱（圖1），箱子頂部開(kāi)有3個(gè)直徑為1cm的孔，并用醫(yī)用膠管分別與純氧氣罐、CO罐及氣體采樣器相連，箱內(nèi)由上層隔板及下層隔板分為三層，上層隔板上面放置氣壓計(jì)，檢測(cè)箱內(nèi)氣壓，使其維持在大氣壓水平，下層隔板上面放置SD大鼠，箱底預(yù)先放置生石灰以吸收大鼠呼出的二氧化碳。染毒過(guò)程中使用Z6-1氣體采樣器（鶴壁市利鑫儀器儀表有限公司）采集箱內(nèi)氣體，并使用CO及氧氣濃度快速檢測(cè)管（上海玻璃儀器廠）檢測(cè)箱內(nèi)CO及氧氣濃度，根據(jù)濃度檢測(cè)結(jié)果通過(guò)導(dǎo)管間斷補(bǔ)充CO和氧氣，維持CO濃度的相對(duì)恒定。

分別往A組、B組、C組大鼠所在染毒箱內(nèi)注入99.8%CO氣體0.48 L、1.44 L、2.40 L[2]，計(jì)算公式：CO濃度=（注入CO氣體體積/染毒箱體積）×M/22.4×103；M為CO分子量。大鼠在箱內(nèi)靜式吸入含CO的空氣，其間用CO快速檢測(cè)管測(cè)定箱內(nèi)CO濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果間斷補(bǔ)充CO和氧氣，使CO濃度恒定為1 250、3750、6250mg/m3。持續(xù)通CO直至染毒箱中大鼠均死亡。

往D組大鼠所在染毒箱內(nèi)持續(xù)通入99.8%CO氣體至大鼠死亡。

1.2.2 行為學(xué)觀察

觀察每組大鼠染毒后的行為學(xué)特征；待染毒箱內(nèi)大鼠均停止呼吸后，立即打開(kāi)染毒箱，收集大鼠標(biāo)本。

1.2.3 標(biāo)本收集及處理

染毒大鼠用組織剪打開(kāi)胸腔，用無(wú)菌注射器抽取右心室心血約5mL，置于含有肝素的真空抗凝管中。取出腦、心臟、肺、肝等組織置于10%甲醛溶液中固定1周后，石蠟包埋，制成5μm厚的切片進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.2.4 HbCO飽和度檢測(cè)

參照SF/Z JD0107010—2011《血液中碳氧血紅蛋白飽和度的測(cè)定分光光度法》測(cè)定心血中HbCO飽和度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

染毒初始，A組、B組及C組大鼠表現(xiàn)活躍、好動(dòng)，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，繼而出現(xiàn)煩躁，逐漸分散，而后出現(xiàn)安靜、四肢無(wú)力（以雙后肢為甚）、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍，聲音刺激后可緩慢爬行，個(gè)別大鼠出現(xiàn)短時(shí)不同程度的抽搐，呼吸變淺變快，繼而出現(xiàn)張口呼吸，呼吸變深、變慢，最后大部分大鼠在出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間抽搐后死亡，個(gè)別大鼠死亡時(shí)較安靜。D組大鼠染毒后迅速出現(xiàn)四肢無(wú)力（以雙后肢為甚）、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍、呼吸淺快，并立即出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間全身抽搐、尾巴豎起、角弓反張等，最后死亡。

2.2 不同CO濃度條件下大鼠的存活時(shí)間

隨著CO濃度的增加，D組大鼠的存活時(shí)間較A組、B組、C組降低（表1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間進(jìn)行比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 不同CO濃度條件下中毒死亡大鼠的心血HbCO飽和度

采用分光光度法檢測(cè)各組CO中毒死亡大鼠的心血HbCO飽和度，結(jié)果顯示，隨著CO濃度的增加，D組大鼠的HbCO飽和度較A組、B組、C組增高（表1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，除A組、B組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組大鼠的心血HbCO飽和度為（61.9± 11.4）%，其中3例雌性大鼠的心血HbCO飽和度明顯低于其他大鼠，分別為26.3%、29.1%、30.4%；其余各組大鼠心血HbCO飽和度均高于50%。

表1 不同CO濃度下大鼠的存活時(shí)間和心血HbCO飽和度（n=40，±s）

表1 不同CO濃度下大鼠的存活時(shí)間和心血HbCO飽和度（n=40，±s）

注：1）與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2）與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3）與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

組別CO濃度/（mg/m3）存活時(shí)間/min HbCO飽和度/% A組125090.0±32.961.9±11.4 B組375033.8±8.21）64.9±6.0 C組62507.4±2.41）2）77.2±2.21）2）D組持續(xù)通入CO3.1±0.91）2）3）83.7±3.81）2）3）

2.4 組織病理學(xué)改變

不同CO濃度中毒死亡大鼠的組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，腦、心臟、肺、肝等器官內(nèi)血管不同程度的擴(kuò)張、淤血，有較多漿液滲出，組織水腫，并可見(jiàn)不同程度實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性。

3 討論

CO是含碳物質(zhì)不完全燃燒產(chǎn)生的一種無(wú)色、無(wú)臭、無(wú)刺激性有毒氣體，易擴(kuò)散，易溶于氨水，其在空氣中含量極微，若環(huán)境中CO濃度超過(guò)0.625mg/m3即可引起人畜中毒[3]。CO中毒以意外多見(jiàn)，常見(jiàn)原因有日常生活中毒，采礦、冶金、化學(xué)工業(yè)產(chǎn)生CO引起中毒等[4-5]。近些年，隨著互聯(lián)網(wǎng)的興起，信息資源獲取的便捷化，使用CO自殺或他殺的案例也時(shí)有發(fā)生[6]。

懷疑CO中毒死亡的案件中，現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)、尸體檢驗(yàn)以及心血HbCO飽和度的檢測(cè)對(duì)于認(rèn)定死因十分重要，其中尤以心血HbCO飽和度至關(guān)重要。傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)理論認(rèn)為，CO中毒死者典型的尸體表現(xiàn)為尸斑呈櫻桃紅色，皮膚黏膜及漿膜可見(jiàn)斑點(diǎn)狀出血，腦、心臟、肺、腎等器官內(nèi)血管擴(kuò)張、淤血，血管壁通透性增加，有較多漿液滲出，組織水腫，伴廣泛灶性出血，實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性等；CO中毒死者心血中HbCO飽和度應(yīng)達(dá)到50%以上，多為60%～80%；同時(shí)，在現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)CO來(lái)源，才可認(rèn)定為CO中毒死亡[5，7]。然而，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中時(shí)有遇到血液中HbCO飽和度遠(yuǎn)低于致死飽和度的情況[8]。對(duì)于非典型性CO中毒死亡案件（HbCO飽和度低），基層法醫(yī)除了結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)不同條件（如溫度、密閉空間、腐敗程度等）進(jìn)行推斷外，僅能憑借經(jīng)驗(yàn)判定CO中毒死亡；而這些條件參數(shù)并沒(méi)有系統(tǒng)、可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，推斷往往缺乏客觀性的依據(jù)，存在隱患[8]。因此，本研究通過(guò)建立CO中毒死亡動(dòng)物模型，探索不同CO濃度下中毒死亡大鼠心血HbCO飽和度的變化規(guī)律，為非典型性CO中毒死亡案件提供數(shù)據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CO中毒后迅速失去行為能力，表現(xiàn)為肢體癱軟（尤以肌肉發(fā)達(dá)的雙下肢為甚）、反應(yīng)遲鈍，這提示CO對(duì)骨骼?。ㄓ绕潆p下肢）存在嚴(yán)重的損害作用，同時(shí)在一定程度上解釋了實(shí)際案件中死者發(fā)覺(jué)異常后，存在掙扎脫離現(xiàn)場(chǎng)的求生行為，例如向門(mén)外爬行等，但仍無(wú)法脫離CO現(xiàn)場(chǎng)的現(xiàn)象[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著CO濃度的升高，大鼠存活時(shí)間逐漸下降；若無(wú)法脫離CO環(huán)境，可迅速（1～3min）導(dǎo)致行為能力的喪失及死亡。此外，隨著CO濃度的升高，大鼠的心血HbCO飽和度逐漸升高，且低濃度（1250mg/m3）CO條件下心血HbCO飽和度與高濃度（6250mg/m3，持續(xù)通入）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該結(jié)果與以往研究[5]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度（1250mg/m3）CO條件下，存在3例來(lái)源于雌性動(dòng)物的心血樣本HbCO飽和度低于致死飽和度，而在高濃度（6 250 mg/m3，持續(xù)通入）CO條件下未發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象；本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠長(zhǎng)時(shí)間接觸低濃度CO可在心血HbCO飽和度較低時(shí)導(dǎo)致死亡，也印證了個(gè)別案例報(bào)道中死者血液中HbCO飽和度顯著低于致死飽和度，而現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)及尸體檢驗(yàn)支持CO中毒死亡的情況[10]。

綜上所述，本研究成功建立了不同CO濃度下中毒死亡動(dòng)物模型，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒僮骱?jiǎn)單、重復(fù)性好，不僅為進(jìn)一步研究CO中毒奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為其他吸入性有毒氣體的法醫(yī)學(xué)研究提供了參考。本研究詳細(xì)觀察并記錄了CO中毒后大鼠的行為學(xué)特征，提出CO對(duì)雙下肢運(yùn)動(dòng)功能存在嚴(yán)重的損害作用，合理解釋了實(shí)際CO中毒死亡案件中死者難以逃離現(xiàn)場(chǎng)的現(xiàn)象。本研究所得研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步探索人不同CO濃度中毒后HbCO飽和度的變化規(guī)律提供了研究基礎(chǔ)，也為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中CO中毒死亡案件，尤其是非典型性CO中毒死亡案件提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Changes of HbCO in the Blood of Rats with Different CO Concentration and Inhalation Time

CHEN Qing,BAI Jie,LI Chang-rong,ZHANG Wen-fang
（Forensic Medical Examination Center of Beijing Public Security Bureau,Beijing 100192,China）

ObjectiveTo explore the change rules of behavioral characteristics,survival time and saturation of carboxyhemoglobin（HbCO）in different CO concentration to provide experimental basis for the cases of CO poisoning death in forensic practice.MethodsTotal 160 SD rats were randomly divided into four groups.CO with the concentration of 1250mg/m3,3750mg/m3,6 250 mg/m3were continuously and respectively replenished in a self-made toxicant exposure equipment until rats died from poisoning.In different CO concentration,the behavioral characteristics and survival time of poisoning rats were observed and recorded.The saturation of HbCO in heart blood was detected by spectrophotometric method. Organs such as brain,heart,lung and liver,and heart blood were obtained via autopsy and histopathological observation was performed.ResultsThe behavioral characteristics of CO poisoning rats were limp and slow response.There were a gradual decrease of survival time and an increase of HbCO saturation in rats with the increase of CO concentration.Three rats in CO concentration of 1 250 mg/m3group showed lower saturations of HbCO than the lethal dose and this situation hasn’t been found in other groups.ConclusionThe animal model of CO poisoning established under different CO concentration has the advantages such as simplicity and good repeatability,which lays a foundation to the further study for CO and other inhaled toxic gas in the research of forensic sciences.

forensic pathology;carboxyhemoglobin;carbon monoxide poisoning;models,animal;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.003

1004-5619（2016）06-0410-03

2015-11-24）

（本文編輯：鄒冬華）

公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（201302ZDYJ001）

陳慶（1976—），男，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：cq7q7q7q7@163.com