感音神經(jīng)性耳聾的基因治療研究進(jìn)展

吳皓 孫常領(lǐng)

耳聾是人類最常見的致殘性疾病之一，據(jù)WHO 2013年的數(shù)據(jù)，全世界范圍內(nèi)約有3.6億人遭受耳聾的困擾[1]。耳聾不但會造成嚴(yán)重的交流障礙，更為嚴(yán)重的是影響兒童的言語和認(rèn)知功能發(fā)育[2]。耳聾可大致分為三種類型：傳導(dǎo)性耳聾、感音神經(jīng)性耳聾和混合性耳聾[3]。其中，感音神經(jīng)性耳聾占耳聾的大部分。感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸毛細(xì)胞、聽神經(jīng)、聽傳導(dǎo)通路各級神經(jīng)元受損害所導(dǎo)致的聲音感受與神經(jīng)沖動傳遞障礙，其常見的致聾因素有耳毒性藥物使用、感染、噪聲暴露、年齡及遺傳因素等。部分感音神經(jīng)性耳聾患者可以通過藥物治療，但絕大部分患者只能依靠配戴助聽器和/或人工聽覺植入提高聽力[4]。然而，無論是助聽器，還是人工聽覺植入，都僅僅是一種替代治療，其治療效果仍不盡如人意，功能上無法與正常聽力相比。

基因治療是指通過操作遺傳物質(zhì)來干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展，通過替代和糾正異常的致病基因來達(dá)到治療疾病的目的[5]。近年來，隨著遺傳基因與耳聾發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，各種耳聾動物模型的建立，越來越多的學(xué)者試圖通過基因治療的方式來預(yù)防和治療感音神經(jīng)性耳聾。內(nèi)耳膜迷路相對封閉、處于骨性迷路的包繞之中，與周圍組織相對隔離；注入耳蝸內(nèi)的載體可以通過流動的外淋巴液或內(nèi)淋巴液在耳蝸內(nèi)擴(kuò)散[6]。由于這些特殊的解剖和生理特點，使耳蝸在基因治療方面擁有其它器官無法比擬的優(yōu)勢，為內(nèi)耳基因治療提供了理想的環(huán)境。本文將結(jié)合最新的國內(nèi)外研究進(jìn)展，對感音神經(jīng)性耳聾的基因治療進(jìn)展做一綜述。

1 感音神經(jīng)性耳聾基因治療的主要策略

1.1 聽神經(jīng)的保護(hù)與再生

對于重度感音神經(jīng)性耳聾患者，目前主要的治療方法是人工耳蝸植入。然而人工耳蝸植入要求有一定數(shù)量的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。術(shù)后效果取決于殘存螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量。動物實驗結(jié)果表明神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3,NT-3）有助于耳聾后螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活[7～8]。有學(xué)者使用新霉素致豚鼠耳聾后1周，通過腺病毒和腺相關(guān)病毒向豚鼠耳蝸內(nèi)導(dǎo)入BDNF，結(jié)果表明可有效保護(hù)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并且能夠促進(jìn)其神經(jīng)纖維向基底膜方向生長[9]。因此，基因治療和人工耳蝸植入聯(lián)合應(yīng)用有望提高人工耳蝸植入的遠(yuǎn)期療效。

1.2 毛細(xì)胞保護(hù)與再生

毛細(xì)胞是產(chǎn)生聽覺沖動的感受器，人類的毛細(xì)胞一旦缺失，不可再生[10]。毛細(xì)胞的保護(hù)對于防止耳聾具有重要意義?，F(xiàn)實生活中，大的環(huán)境噪聲、耳毒性藥物（如氨基糖苷類抗生素和順鉑）的使用均可導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷。基因治療可以通過表達(dá)某些具有保護(hù)作用的基因或沉默耳毒性發(fā)生過程中的某些關(guān)鍵基因起到保護(hù)毛細(xì)胞和聽力的作用。Kawamoto以腺病毒為載體，通過在豚鼠耳蝸內(nèi)過表達(dá)銅/鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1,SOD1），錳超氧化物歧化酶（SOD2），過氧化氫酶（catolase,CAT）成功地預(yù)防了卡那霉素導(dǎo)致的耳聾[11]。Cooper以腺相關(guān)病毒為載體通過表達(dá)X連鎖凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）來預(yù)防順鉑耳毒性[12]。Mukherjea通過鼓室內(nèi)注射小干擾RNA來拮抗NADPH氧化酶3（NADPH oxidase 3,NOX3）來阻止注射順鉑后氧自由基的產(chǎn)生，從而預(yù)防毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷[13]。

一旦毛細(xì)胞發(fā)生死亡，治療的重點就從毛細(xì)胞的保護(hù)轉(zhuǎn)移到再生。隨著毛細(xì)胞再生研究的深入，已發(fā)現(xiàn)了多個潛在的基因治療靶點，其中最有代表性的是Atoh1基因[14]。Atoh1基因是毛細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)有多項動物研究證明在內(nèi)耳進(jìn)行Atoh1基因的過表達(dá)，通過Corti器支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化實現(xiàn)了耳蝸和前庭毛細(xì)胞再生[15～17]。

1.3 遺傳性耳聾的基因治療

與其他致病因素導(dǎo)致的耳聾不同，遺傳性耳聾的基因治療不能通過毛細(xì)胞的再生來實現(xiàn)，而需要通過導(dǎo)入野生型的基因取代或補充致病基因的功能。近幾年來遺傳性耳聾的基因治療研究取得了很大的突破，已經(jīng)有多項研究通過基因治療的方式逆轉(zhuǎn)了遺傳性耳聾小鼠動物模型的聽力表型。包括GJB6、VGLUT3、TMC、KCNQ1在內(nèi)的基因敲除小鼠，都通過向耳蝸內(nèi)導(dǎo)入相應(yīng)的野生型基因，成功地保留了部分聽力[18～21]。這一系列研究成果預(yù)示基因治療有望成為治療遺傳性耳聾的有效方法。

2 感音神經(jīng)性耳聾基因治療載體

基因治療的開展首先需要有理想的基因治療載體，目前常見的基因載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。由于轉(zhuǎn)染效率較高，病毒載體是應(yīng)用最為廣泛的載體。用作耳聾基因治療載體的病毒主要有腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。其中最為常用的是腺病毒和腺相關(guān)病毒。

2.1 腺病毒（adenovirus,AV）

腺病毒具備①感染非分裂和分裂細(xì)胞；②可高效、迅速地傳遞和表達(dá)基因；③易于制備；④基因組不整和進(jìn)入宿主染色體而相對安全等優(yōu)點。被廣泛應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療的研究中[22]。Raphael通過圓窗膜注射的方法，將載有大腸桿菌β-半乳糖（LacZ）的腺病毒導(dǎo)入鼓階內(nèi)，結(jié)果顯示耳蝸毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管紋、前庭膜、螺旋韌帶均被轉(zhuǎn)染，其中以螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高[23]。其他研究也證實了腺病毒經(jīng)鼓階鉆孔途徑可以成功轉(zhuǎn)染包括毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及支持細(xì)胞在內(nèi)的多種內(nèi)耳細(xì)胞[24，25]。但是腺病毒有一定的毒性，免疫源性較強(qiáng)，并且只能實現(xiàn)目的基因的短暫表達(dá)（1個月），因此應(yīng)用受到了很大限制[23，26]。

2.2 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）

AAV無致病性和毒性，因被轉(zhuǎn)染的基因整合入宿主的基因組內(nèi)，所以能夠長時間表達(dá)[27]。動物實驗證明，AAV既能夠感染毛細(xì)胞，又能夠感染支持細(xì)胞[19～21]。不同血清型的AAV對耳蝸內(nèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也不相同，Askew通過小鼠耳蝸組織體外培養(yǎng)實驗證明，在AAV1、2、6、8、9血清型中，AAV1/2對毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，體內(nèi)實驗也證實了這一點[20]。但是，腺相關(guān)病毒DNA裝載量有限，制備比較困難，并且會引起宿主的免疫反應(yīng)，限制了其應(yīng)用[28]。

2.3 非病毒載體

與病毒載體相比較，非病毒載體具有諸多的優(yōu)勢，例如制備簡單，毒性低，不會誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，對攜帶基因容量沒有限制，可以通過生物學(xué)改造來獲得多種生物學(xué)特性等。非病毒基因載體主要有陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、納米材料。近年來用于內(nèi)耳基因治療的非病毒載體主要有聚乙烯亞胺（polyethylene imine,PEI）[29]、聚酰胺-胺型樹狀物（PAMAM-D）[30]、羥基磷灰石納米顆粒[31]、四氧化三鐵納米顆粒等[32]，但這些非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率相對較低。

理想的基因治療載體應(yīng)該具備以下條件：①在體內(nèi)能夠?qū)NA準(zhǔn)確送入靶細(xì)胞和靶組織；②能夠?qū)NA轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞核并高效表達(dá)；③轉(zhuǎn)染效率較高，強(qiáng)度和時間可控；④安全性高；⑤易于大規(guī)模制備?，F(xiàn)階段，無論是病毒載體還是非病毒載體都還無法滿足上述條件，感音神經(jīng)耳聾基因治療的開展，仍需要探索新型的基因載體。

3 感音神經(jīng)性耳聾基因治療載體導(dǎo)入途徑

內(nèi)耳血迷路屏障的存在、骨性結(jié)構(gòu)包裹以及淋巴液流動的特點使得內(nèi)耳適合于基因治療。同時,也使得如何安全、高效地將目的基因轉(zhuǎn)入至耳蝸內(nèi)成為一個難題。因此，探索一條安全有效的內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)移方法是開展內(nèi)耳基因治療的重要前提之一。目前在動物實驗研究中常用的基因?qū)胪緩接幸韵聨追N：①經(jīng)耳蝸開窗；②經(jīng)半規(guī)管開窗；③經(jīng)圓窗膜注射；④經(jīng)完整圓窗膜滲透。

3.1 耳蝸開窗

經(jīng)耳蝸開窗后，可以行鼓階或中階注射，相對于鼓階注射，中階注射能更加直接地將目的基因?qū)雰?nèi)淋巴，轉(zhuǎn)染效率也更高，文獻(xiàn)報道經(jīng)中階注射AAV后幾乎可以轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)所有類型的細(xì)胞。然而，無論是鼓階注射，還是中階注射均會造成一定程度的聽力損失[33]。

3.2 半規(guī)管開窗

半規(guī)管開窗路徑主要是在后半規(guī)管開窗，動物實驗研究表明此種路徑對聽力的影響較小，但是，經(jīng)此路徑主要轉(zhuǎn)染前庭細(xì)胞，較少轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[24，34]。

3.3 經(jīng)圓窗膜注射

將AAV經(jīng)圓窗膜注射途徑導(dǎo)入鼓階后，目的基因可以表達(dá)于外淋巴間隙的間皮細(xì)胞，內(nèi)、外毛細(xì)胞，支持細(xì)胞，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[35]。但是經(jīng)圓窗膜注射容易造成圓窗膜的破裂，形成外淋巴瘺，也會對聽力造成輕微的影響[19]。

3.4 經(jīng)圓窗膜滲透

經(jīng)完整圓窗膜滲透可以通過鼓室內(nèi)注射或者耳后切開途徑來實現(xiàn)，操作簡單，對聽力影響小，是向內(nèi)耳導(dǎo)入基因最為理想的一條途徑。圓窗膜是位于中耳與內(nèi)耳之間的唯一膜性結(jié)構(gòu)，在正常情況下是一半透膜，通透性大小主要與滲透分子的大小、構(gòu)型、濃度、脂溶性、所帶電荷有關(guān)。許多種物質(zhì)包括水、離子、大分子（如毒素）、抗生素、直徑小于1μm的微球都能透過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳[36]。然而，作為耳聾基因治療常用載體，病毒卻不易透過圓窗膜。因此，許多學(xué)者嘗試采用易化劑（透明質(zhì)酸、膠原酶等）來增加圓窗膜的通透性。Shibata等發(fā)現(xiàn)使用透明質(zhì)酸預(yù)先處理圓窗膜可以明顯增加圓窗膜對腺病毒的通透性，從而提高腺病毒在耳蝸內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率[37]。國內(nèi)王慧和夏力使用膠原酶處理圓窗膜后，通過圓窗膜滲透途徑向豚鼠和小鼠耳蝸內(nèi)導(dǎo)入AAV，取得了和經(jīng)圓窗膜注射途徑類似的轉(zhuǎn)染效率[35，38]。

4 展望

感音神經(jīng)性耳聾基因治療的基礎(chǔ)研究雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是要實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化還有很長的一段路要走。目前限制基因治療向臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙是缺乏理想的基因載體和基因?qū)胪緩?。①基因治療載體；鑒于非病毒載體的安全性較高，相對于病毒載體而言，非病毒載體更有希望成為耳聾基因治療的理想載體。非病毒載體的主要缺點是轉(zhuǎn)染效率較低和缺乏靶向性，如何提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率和靶向性是今后研究的熱點。通過對納米粒子表面進(jìn)行多種修飾（如穿膜肽[39]和靶向配體[40]）的多功能復(fù)合基因載體也許是人類基因治療載體發(fā)展的方向。②基因?qū)胪緩?；目前最有希望進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的基因?qū)胪緩绞墙?jīng)完整圓窗膜滲透。病毒載體通過新型易化劑對圓窗膜進(jìn)行預(yù)處理；非病毒載體通過改變粒徑，表面電荷，連接穿膜肽等方法有望進(jìn)一步提高圓窗膜滲透途徑的轉(zhuǎn)染效率。如果上述問題能夠得到解決，我們有理由相信在不遠(yuǎn)的將來基因治療將成為治療感音神經(jīng)耳聾的有效方法。

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